[发明专利]一种敲除SDHB基因的细胞株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种敲除SDHB基因的细胞株及制备该细胞株的sgRNA、方法和应用，属于基因工程技术领域。所述sgRNA的序列如SEQ ID No.2所示。利用本发明的sgRNA，可制备得到敲除SDHB基因的细胞株，进一步直接作为或诱导肿瘤制备组织切片作为检测SDHB表达的质控品，具有重要的临床价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种敲除SDHB基因的细胞株及制备该细胞株的sgRNA、方法和应用。

背景技术

琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDH)也称复合体II或琥珀酸：醌氧化还原酶，由SDHA、SDHB、SDHC和SDHD四个亚单位组成。SDH是柠檬酸循环和电子传递链的一个关键组分，尤其是，它还与琥珀酸的氧化反应有关：在三羧酸循环中，SDH将琥珀酸氧化成延胡索酸盐，然后参与电子链传递。SDH在正常组织细胞中均有正常胞浆阳性表达，当SDH的任何成分出现双等位失活时，SDHB免疫组化染色都是阴性，这在无综合征的情况下比较罕见。因此，SDHB免疫组化染色阴性是综合征疾病的标志，通常为SDH亚单位之一的胚系突变。SDHB表达缺失的肿瘤称为SDH缺陷性肿瘤。除SDHB缺失外，携带SDHA突变的肿瘤也显示SDHA表达缺失。15％的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PHEO/PGL)与SDH胚系突变有关，因此也称为SDH缺陷性肿瘤。故临床上一般建议对所有PHEO/PGL进行SDHB免疫组化筛选。SDH缺陷性肾癌是2016版肾脏肿瘤WHO分类的新类型，肿瘤细胞质呈嗜酸性、空泡状，可见胞质包涵体，该病可发生SDHC和SDHA突变，但SDHB突变更为常见。另外，还有较少见的SDH缺陷性垂体腺瘤。

研究表明，SDHB免疫组化是强大而可靠的SDH突变的检测方法。但SDHB免疫组化染色结果必须谨慎判读，一般需要SDHB靶标的阴性对照组织。然而，由于SDHB天然突变组织少，难以获取，造成SDHB免疫组化实验结果的可靠性降低，加大临床应用难度。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种利用基因编辑技术(CRISPR Cas9基因敲除)，构建SDHB缺失表达的HCT-116细胞株的sgRNA、载体及制备方法。使得制备的细胞株可实现在缺少SDHB阴性组织的条件下，实现SDHB免疫组化检测中的阴性质量控制，更加有利于诊断结果的辅助判断。为此，本发明的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种特异性靶向SDHB基因CCDS的sgRNA2，所述sgRNA2的序列如SEQ ID No.2所示。

应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列(及本发明中的其他序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列也在本发明的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本发明的保护范围之内。

在本发明中，所述sgRNA2靶向SDHB基因CCDS的第1个外显子。利用SEQ ID No.2所示的sgRNA2构建的慢病毒载体，转染效率明显高于利用SEQ ID No.1所示的sgRNA1和SEQID No.3所示的sgRNA3构建的慢病毒载体。SEQ ID No.2所示的sgRNA2具有特殊的性能，这是本领域技术人员无法预期的。

本发明第二方面提供一种载体，所述载体包含所述sgRNA2，所述载体是慢病毒载体。

在本发明的一些实施方案中，含有所述sgRNA2的慢病毒载体是靶向剪切SDHB基因CCDS的CRISPR-Cas9重组表达慢病毒载体，其含有特异性靶向基因CCDS的sgRNA2和Cas9蛋白，并带有Puro筛选标记。

在本发明的一些实施方案中，所述载体为LentiCRISPRv2GFP载体。