[发明专利]雪胆细胞色素氧化酶基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用

说明书

本发明公开了一种雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用。鉴别获得雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因，极大地推进了雪胆素(葫芦素IIa和葫芦素IIb)生物合成路径关键酶基因的挖掘，不仅能够帮助育种家进行分子标记辅助育种，而且还可以借助代谢工程和合成生物学方法对葫芦素进行工业化生产，也将为新药开发提供新的思路。提供了含有雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59的重组质粒、转基因工程菌和酿酒酵母重组菌Cuol04，为通过生物工程方法合成11‑羰基‑20β‑羟基‑Cuol、11‑羰基‑Cuol以及11‑羰基‑2β,20β‑二羟基‑Cuol，进一步为雪胆素生物合成调控研究奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用。

背景技术

葫芦素虽具有细胞毒性，但是药用价值很高，尤其是在抗肿瘤方面。由于葫芦素有毒这方面的特性，限制了其临床研究，因此只有少部分的葫芦素被开发为药物。雪胆植物块茎中富含葫芦素类成分，特别是从该属植物块茎中提取的雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素混合物)是生产中成药的是雪胆素片(中药保护品种)、雪胆素胶囊的原料药，该药具有清热解毒、抗菌消炎的功能，临床上主要用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等多种疾病。与其他葫芦素化合物不同的是，研究者发现葫芦素IIa(雪胆甲素)具有明显的细胞毒性作用，通过抑制JAK2/STAT3下游的生存素(Survivin)，达到抑制肿瘤细胞的增殖作用，使其成为一类新型的抗癌药物。

研究表明，葫芦素生物合成起始于2,3-氧化鲨烯环化形成的葫芦二烯醇(Cuol)，是由氧化鲨烯环化酶(OSCs)家族的葫芦二烯醇合酶(CBS)催化。特殊地，罗汉果苷既可来自2,3-氧化鲨烯，也可来自2,3；22,23-双氧化鲨烯。葫芦二烯醇在细胞色素P450的催化下，通过引入羟基、羧基或环氧基进行特定部位的氧化修饰，从而产生多种多样的四环三萜类化合物。多功能的CYP87D20则连续地催化Cuol的C11氧化和C20位羟化，形成11-羰基-20β-羟基-Cuol和11-羰基-Cuol，接下来，CYP81Q59催化其C2位的β羟化，形成11-羰基-2β,20β-二羟基-Cuol，可见，这些中间体是葫芦素最终体生物合成途经上必要的单体化合物。

细胞色素氧化酶CYP450是一类超基因家族编码的含有血红素-铁硫蛋白，在真核生物内，CYP450氧化酶为膜锚定蛋白，能够与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器结合，主要定位于内质网中，在生物体内参与多种重要物质的代谢和氧化，其在生物化学反应中能够将一个氧原子插入到疏水性分子中从而获得较高的活性或亲水性，又被称为单加氧酶(Mixed-function oxidase,MFO)。

葫芦素这类化合物高度被氧化，在植物中的含量较低，利用受到限制，提取纯化工艺复杂且耗时，需投入大量的人力物力等资源。目前，相关药物的开发中，主要通过从植物中提取的方式来制备。现今要实现对葫芦素的化学合成仍存在诸多挑战。特别是葫芦素关键中间体化合物。随着合成生物学和代谢工程的发展，为四环三萜类化合物高效异源合成提供了新的契机，酿酒酵母作为真核表达系统，遗传背景清晰，遗传改造策略成熟，其内源的甲羟戊酸(MVA)途径可为更多的萜类物质合成提供所需的前体物质，利于萜类物质的合成。然而，有关葫芦素毒副的报道并不能阻挡这类化合物作为有效药物的潜在用途。对葫芦素的各种官能团进行修饰，比如羟基化以及酮基化修饰获得中间体以减少毒副作用，可能为将来的研究提供重要的先导化合物。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因在制备葫芦素中间体中的应用。