[发明专利]基于亚细胞水平空间芯片的三色荧光解码方法

权利要求书

1.基于亚细胞水平生物芯片的三色荧光解码方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、生物芯片的制备：将连接有引物1、引物2和引物3的二氧化硅微球固定在孔板的孔位处，即得生物芯片；

B、芯片与解码探针杂交：将带有不同荧光标签的解码探针I、解码探针II和解码探针III混合后与生物芯片进行杂交反应，然后检测相应荧光信号；

C、芯片解链与清洗：通过氢氧化钠解链杂交后的生物芯片，解链后的生物芯片洗净、烘干后，再次杂交下一轮解码探针；

D、重复步骤B～C 2～9次，实现芯片解码；

其中，引物1、引物2、引物3各包括4-384种引物序列；引物1、引物2、引物3按照5′-3′依次串联连接；

解码探针I是与引物1互补的寡核苷酸单链，解码探针II是与引物2互补的寡核苷酸单链，解码探针III是与引物3互补的寡核苷酸单链。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述的二氧化硅微球为羧基化二氧化硅微球。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A包括：将引物1的4-384种引物序列分别通过氨基羧基缩合反应连接到羧基二氧化硅微球上，完成连接后将微球混合清洗，均匀分成4-384份，每份加入引物2的4-384种引物序列进行连接反应，完成连接后将微球混合清洗，均匀分成4-384份，每份加入引物3的4-384种引物序列进行连接反应，完成连接后，将微球混合均匀铺到微孔玻璃板上，并将其固定在孔位处，即得生物芯片。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述的荧光标签选自DAPI、FITC、Alexa fluor 488、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、TRITC、Cy7。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B所述的杂交反应在杂交缓冲液中进行；所述杂交缓冲液的成分为：1-10mM NaCl、2-5mM Tris-HCl、1-3mM MgCl₂和0.5-5mMDTT。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤B中，混合后解码探针的浓度为1nM-50nM，将10μL混合后的解码探针与40-190μL杂交缓冲液混合，加至孔位中，与生物芯片进行杂交反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤B进行杂交反应的条件为：37-60℃反应5-20min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤C包括：

C1、向各孔位中加入0.1-2M氢氧化钠溶液100μL静置1-10min，然后倒掉孔位中的溶液；

C2、重复步骤C1 2～3次以保证解链完全；

C3、解链后的生物芯片用NFW清洗1～3次，烘干后再次杂交下一轮解码探针。

9.权利要求1-8任一项所述方法在亚细胞水平的空间组学研究中的应用。