[发明专利]一种冷冻休克中性粒细胞及其制备方法

说明书

本发明专利公开了一种冷冻休克中性粒细胞及其制备方法，其制备方法包括如下步骤：S1取新鲜EDTA‑K2抗凝血，以保证细胞的最优状态；S2用中性粒细胞提取试剂盒分离获得中性粒细胞。本发明制备的冷冻休克中性粒细胞制备流程是通过大量条件摸索获得，相比于向中性粒细胞中添加冻存液后立即进行液氮冻死（这种方式对细胞的损伤很大，使冷冻后的中性粒细胞脆性增加，易破碎），在本发明中，添加冻存液后，先在‑80℃降温15‑25 min后再进行液氮冻死，在保证细胞死亡的前提下通过减少细胞冷冻过程中的冰晶形成进而减少对细胞器、细胞膜的损伤，以得到细胞结构更完整的细胞，其膜受体吸附功能也得到保留。

技术领域

本发明专利涉及死细胞载体技术领域，具体为一种冷冻休克中性粒细胞及其制备方法。

背景技术

炎症是大多数急性和慢性病的常见事件之一，也是当今现代生活方式诱导发病的主要原因，炎症是由炎性细胞因子和炎性细胞共同作用导致的，会引发组织损伤、坏死等，如果不加以控制，炎症就会导致全身各种疾病，过量释放的多种炎性细胞因子是炎症的重要原因，其不仅会招募免疫细胞到达炎症部位，而且具有直接损伤组织细胞的功能，其中，对于过量释放的多种细胞因子，目前临床上主要通过血液净化术、细胞因子拮抗剂、抗体、纳米材料等来对炎症介质或有毒物质进行吸附去除，但血液净化术可能导致凝血反应等一系列副作用；单独使用一种细胞因子拮抗剂或抗体达不到好的治疗效果，同时使用多种拮抗剂或抗体成本高且风险大；纳米材料也存在着免疫排斥风险，鉴于其疗效和副作用，以上方法并不能达到很好的细胞因子清除效果，

中性粒细胞作为人类血液中含量最高的白细胞(占白细胞总量的50％-70％)，具有吞噬并杀灭进入血液的细菌等的天然免疫功能，中性粒细胞也是参与炎性浸润的主要细胞之一，在之前的报道中发现中性粒细胞膜表面表达多种炎性细胞因子的受体，具有广泛吸附和中和多种炎性细胞因子的潜能，以中性粒细胞膜为原料制备为纳米颗粒有助于类风湿关节炎的抗炎治疗，但是，纳米颗粒的制备过程中会造成膜成分的大量损失，而外源性中性粒细胞膜不可避免产生同种异体免疫排斥反应，因此，在保证中性粒细胞膜吸附能力的情况下，我们拟通过一种新型的冷冻休克技术，在实现中性粒细胞死亡(丧失炎性浸润和炎性细胞因子释放功能)的前提下，保留其细胞膜蛋白受体的完整性，从而有效吸附和中和多种炎性细胞因子，改善过度炎症造成的组织器官损伤。

发明专利内容

本发明专利的目的在于提供一种冷冻休克中性粒细胞及其制备方法，为实现上述目的，本发明专利提供如下技术方案：一种冷冻休克中性粒细胞及其制备方法，其方法包括如下步骤：

S1，取新鲜EDTA-K2抗凝血，以保证细胞的最优状态；

S2，用中性粒细胞提取试剂盒分离获得中性粒细胞：细胞悬液体积小于5mL时，在离心管中先加入4mL试剂A，后将2mL试剂C小心叠加于试剂A之上，形成梯度界面，将新鲜抗凝血平铺到C液液面上方，保持两液面界面清晰；

S3，室温，水平转子500-1000g，离心20-30min，升降速均为1；

S4，离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层；

S5，用吸管小心吸取试剂C与试剂A之间以及试剂A中的中性粒细胞到15mL洁净的离心管中，加入10mL PBS或细胞洗涤液洗涤细胞，250g,离心10min；

S6，弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min；

S7，重复步骤6；

S8，弃上清，细胞重悬并计数；

S9，添加通用血清型非程序冻存液，先在-80℃降温15-25min，再直接导入液氮进行冷冻休克，在-80℃降温20min是根据冻存原理，使一部分冻存液渗透到细胞内，减少冰晶的形成，从而降低了冷冻对细胞的损伤并且能维持更好的细胞结构完整性，避免细胞破碎后引起的细胞黏连；