[发明专利]一种呋喃甲醛耐受酵母突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种呋喃甲醛耐受酵母突变体及其制备方法和应用，所述呋喃甲醛耐受酵母突变体为将酵母中SIZ1基因进行突变所得，SIZ1基因突变方式对应氨基酸序列的变化为以下一种：F268A、D345A、S391D、FKS删除或AAA插入。与现有技术相比，本发明构建得到的呋喃甲醛耐受酵母突变体能够耐受高浓度呋喃甲醛，不仅为酿酒酵母工程菌株的定向改造提供了技术基础，还可为燃料乙醇发酵生产工艺提供适用菌株，推动工业生产力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种呋喃甲醛耐受酵母突变体及其制备方法和应用。

背景技术

微生物工业发酵过程中会产生乙酸、呋喃甲醛和羟甲基糠醛(HMF)等抑制物。这些抑制物可改变细胞膜结构，诱导氧化应激，影响线粒体功能，破坏DNA与蛋白质的合成，极大地影响微生物细胞生长和工业发酵生产。在呋喃甲醛的胁迫下，酵母细胞的代谢过程受到强烈的抑制，生长停滞期延长，导致产物得率降低。其中呋喃甲醛作为电子受体，与乙醛进行竞争，导致乙醛积累，从而推迟乙酸和乙醇的生成，并且呋喃甲醛的存在会抑制乙醇脱氢酶(ADH)、丙酮酸脱氢酶(PDH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的活性。此外，呋喃甲醛还可以诱发酵母细胞内总活性氧(ROS)水平的大量积累，引起细胞内线粒体、空泡、肌动蛋白、染色体的损伤，从而造成细胞死亡。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在耐受终浓度乙醇、葡萄糖转化率方面具有优势，但在耐受呋喃甲醛方面优势不明显。

为了改善发酵过程中菌株耐受呋喃甲醛的能力，可以在发酵培养基中额外添加一些物质来进行改善。比如，公开号为CN110029135A的发明公开了一种提高木质纤维素水解液发酵速率的方法，所述方法包括如下步骤：1)制备木质纤维素水解液，然后向木质纤维素水解液中加入生物质炭，混匀得混合溶液，2)向混合溶液中加入发酵培养液，然后接种微生物，进行发酵，即可。该发明通过加入生物质炭来减小木质纤维素水解液中抑制物乙酸、呋喃甲醛和酚类物质对微生物发酵的抑制作用，从而提高发酵速率。

也有研究表明，对菌株中的某些基因进行突变处理，也能够起到改善发酵过程中菌株耐受呋喃甲醛的能力。比如，公开号为CN104845924A的发明公开了一株耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，该耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为K219E、V522G和Q649L，该耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌能耐受浓度至少为3g/L的呋喃甲醛；该耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas.mobilis ZM4-MF，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC：NO.10616，保藏时间为2015年3月12日。

然而，对于作为发酵使用更常用的酿酒酵母如何提高对高浓度呋喃甲醛的耐受性能，还有待进一步研究。

发明内容

本申请研究发现通过同源重组的方法定向对酿酒酵母中SIZ1基因进行突变(Genomic Sequence:NC_001136.10；NCBI Reference Sequence:NM_001180717.3)，可显著提高酿酒酵母对呋喃甲醛的耐受性。

一种呋喃甲醛耐受酵母突变体，将酵母中SIZ1基因进行突变所得，SIZ1基因突变方式对应氨基酸序列的变化为以下一种：

(1)F268A：将氨基酸序列第268位由苯丙氨酸突变为丙氨酸；

(2)D345A：将氨基酸序列第345位由天冬氨酸突变为丙氨酸；

(3)S391D：将氨基酸序列第391位由丝氨酸突变为天冬氨酸；

(4)FKS删除：将氨基酸序列第268-270位点苯丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸删除；

(5)AAA插入：在氨基酸序列第267位氨基酸位点后插入三个丙氨酸。