[发明专利]体内靶向诱变的系统

权利要求书

1.一种体内靶向诱变的系统，其特征在于包括：

位点特异性切口酶；

低保真性DNA聚合酶；

由两个短肽组成的二聚化短肽体系；

其中二聚化短肽体系中的第一短肽与位点特异性DNA切口酶形成融合蛋白，第一短肽位于位点特异性DNA切口酶的N端或C端，二聚短肽中的第二短肽与低保真性DNA聚合酶形成融合蛋白，第二短肽位于低保真性DNA聚合酶的N端或C端。

2.权利要求1所述的体内靶向诱变的系统，其特征在于：

所述位点特异性切口酶的识别序列在靶基因的一端或两端设置；

位点特异性切口酶的切割位点位于位点特异性切口酶识别序列的3’端，且切割后3’端保留羟基末端；

所述低保真性DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶活性。

3.权利要求2所述的体内靶向诱变的系统，其特征在于：所述低保真性DNA聚合酶具有链置换能力或者5’-3’外切酶活性。

4.权利要求1所述的体内靶向诱变的系统，其特征在于：所述位点特异性切口酶为M13噬菌体的pII蛋白变体、艰难梭状芽孢杆菌的RepA蛋白变体、嗜热脂肪芽孢杆菌的BsmAI蛋白变体、短芽孢杆菌的BbvCI蛋白变体、atlanticus交织杆菌的BspQI蛋白变体、AlwI蛋白变体、嗜热脂肪芽孢杆菌的BstNBI蛋白变体、BspD6I蛋白变体、I-SceI-BstNBI融合蛋白变体、PI-SceI-BstNBI融合蛋白变体、PI-PspI-BstNBI融合蛋白变体、I-CeuI-BstNBI融合蛋白变体、araI-BstNBI融合蛋白变体、Cas9n蛋白变体、Cas12n蛋白变体、dCas9-BstNBI蛋白变体或dCas12-BstNBI蛋白变体。

5.根据权利要求4所述的体内靶向诱变的系统，其特征在于：所述位点特异性切口酶为：

切口酶M13噬菌体的pII蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:1，DNA序列见SEQ IDNO:2；

艰难梭状芽孢杆菌的RepA蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:3，DNA序列见SEQ IDNO:4；

BspD6I蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:5，DNA序列见SEQ ID NO:6；

PI-SceI-BstNBI融合蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:7，DNA序列见SEQ ID NO:8；

或者Cas12n蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:9，DNA序列见SEQ ID NO:10。

6.权利要求1所述的体内靶向诱变的系统，其特征在于：所述低保真性DNA聚合酶为BstDNA聚合酶重组蛋白变体、Bsu DNA聚合酶重组蛋白变体、phi29 DNA聚合酶重组蛋白变体、DNA聚合酶I重组蛋白变体、DNA聚合酶II重组蛋白变体、DNA聚合酶III重组蛋白变体、TaqDNA聚合酶重组蛋白变体、T3 DNA聚合酶重组蛋白变体、T4 DNA聚合酶重组蛋白变体、T5DNA聚合酶重组蛋白变体、T7 DNA聚合酶重组蛋白变体、Deep Vent DNA聚合酶重组蛋白变体或Sulfolobus DNA聚合酶IV重组蛋白变体。

7.权利要求6所述的体内靶向诱变的系统，其特征在于：所述低保真性DNA聚合酶为：Bst DNA聚合酶重组蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:11，DNA序列见SEQ ID NO:12；

phi29 DNA聚合酶重组蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:13，DNA序列见SEQ IDNO:14；

DNA聚合酶I重组蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:15，DNA序列见SEQ ID NO:16；

T5 DNA聚合酶重组蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:17，DNA序列见SEQ ID NO:18；

或者T7 DNA聚合酶重组蛋白变体，其氨基酸序列见SEQ ID NO:19，DNA序列见SEQ IDNO:20。