[发明专利]一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法及应用。本发明方法采用脂质体包裹dsRNA，再导入草地贪夜蛾，本发明的脂质体包裹dsRNA的RNAi后，能够有效的传递dsRNA进入草地贪夜蛾体内，干扰效果显著，能够满足草地贪夜蛾体内基因的功能研究。且制备方法简单快速，具有实际应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法和应用。

背景技术

目前害虫的RNAi的方法主要包括转基因介导法、微量注射法、饲喂法等。转基因植物介导法周期长，难度较大，干扰效果不明显。微量注射法成本高，操作系数大、很难在田间进行大规模应用。饲喂法是直接在体外合成dsRNA，将dsRNA配置成溶液直接饲喂害虫，但是dsRNA在体外易降解，特别是鳞翅目昆虫肠道含有大量核酸降解酶极易降解dsRNA,从而影响干扰效果。纳米粒子近十几年被广泛用于RNAi，能够保护dsRNA不被昆虫消化道的各种酶降解。

脂质体（Liposomes）由Bangham等人提出，现在普遍指将磷脂等类脂质分散于水中所形成的具有双分子层包裹水相结构的封闭小囊泡，由于脂质体与细胞磷脂结构的生物相容性，以脂质体对 dsRNA 进行包被能够提高细胞对dsRNA 的吸收效率，并且具有极好的生物相容性。

目前利用各种外界材料提升草地贪夜蛾RNAi效应报道较少，效果不明显，更多的应用集中在使用昆虫细胞中，对活体昆虫的研究尚无具体定论。因此挖掘利用提升草地贪夜蛾RNAi效率的组合材料，对于利用RNAi的草地贪夜蛾害虫防控具有十分重要的意义。本发明首次在鳞翅目昆虫中报道了一种可以提升昆虫RNAi效率的方法，且该组合简单易制备，并且能够使得对应的dsRNA在脂质体包裹下在草地贪夜蛾中稳定传递并吸收。

发明内容

本发明提供一种用于草地贪夜蛾的RNAi的纳米颗粒方法和用途，此种dsRNA的纳米颗粒可以更加稳定的在草地贪夜蛾体内传递和吸收，满足草地贪夜蛾特定基因的干扰。

本发明提供一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法，其采用脂质体包裹dsRNA，再导入草地贪夜蛾。

优选地，所述dsRNA与Lipofetamine2000混合实现脂质体包裹dsRNA。

更具体地，将Lipofetamine2000溶于RNase-free water混匀，室温静置3-8min；再将所述dsRNA 与其混匀，最终得到复合物，放置冰上待用。

优选地，所述复合物现配现用。

更具体地，Lipofetamine2000购买自Thremo公司，使用时稀释100-300倍，优选为200倍；dsRNA 使用的终浓度为100-200 ng/ul ，优选为150ng/ul。

在具体实施方式中，所述dsRNA是针对 V-ATPase基因。

更具体的，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的一个具体实施方式中：将1µl Lipofetamine2000溶于100 µl RNase-free water混匀，室温静置5min；将10µl dsRNA加至90 µl RNase-free water中，最后将稀释过后的dsRNA和Lipofetamine 2000混匀，放置冰上待用。

本发明提供所述的方法在草地贪夜蛾进行干扰中的应用。具体地，采用所述的复合物饲喂草地贪夜蛾幼虫，优选地连续饲喂一周。

本发明具有以下优点：本发明的脂质体包裹dsRNA的RNAi后，能够有效的传递dsRNA进入草地贪夜蛾体内，干扰效果显著，能够满足草地贪夜蛾体内基因的功能研究。且制备方法简单快速，具有实际应用价值。