[发明专利]基于DNA核酶和SELEX技术的适配体筛选方法及苯丙氨酸适配体

说明书

本发明公开了基于DNA核酶和SELEX技术的适配体筛选方法及苯丙氨酸适配体。本发明的筛选方法可以解决目前SELEX技术所存在的实验设计困难、筛选流程复杂等问题，更重要的是，运用此方法筛选得到的适配体一方面是适体酶，另一方面又是能够自我剪切的DNA核酶，是一种异构核酶(Allosteric ribozyme)，可以直接通过剪切片段显示配体的结合程度，并用于定量检测配体的浓度。另外，该方法不需要固定配体或者适配体，使得筛选过程更加简便。总而言之，此方法可以用于筛选产生适配体从而用于科研和临床检测等多种用途。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的适配体筛选方法。

背景技术

目前适配体主要是由一种名为“SELEX”的体外筛选技术而得到。传统的SELEX技术是以合成的随机DNA文库开始的，需要固定配体或者适配体用于筛选，其过程十分繁琐，并耗时较长。随后，各种新的SELEX技术随之被开发出来，例如：对于大分子分离有效的硝酸纤维素膜过滤的SELEX、基因组SELEX(Genomic SELEX)、small RNA transcriptomic SELEX(smaRt-SELEX)、Capture-SELEX等，这些改良技术使SELEX的应用更为广泛。但遗憾的是目前存在的SELEX技术仍然存在实验设计困难、筛选流程复杂等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了基于DNA核酶和SELEX技术的适配体筛选方法及苯丙氨酸适配体。本发明的目的一方面是解决现有的SELEX技术存在的问题，提出一种全新的DNA适配体筛选方法，包括将II类核酶(II-R1)整合到筛选文库里，因而不用固定配体或者适配体，以及应用Lambda exonuclease(外切酶)分离纯化单链DNA，获得更纯的单链DNA，提高筛选效率；另一方面，本发明筛选所用的小分子L-苯丙氨酸是苯丙酮尿症的靶标分子，在正常人血液中苯丙氨酸的量较少，而在苯丙酮尿症中则明显升高，因此测定血液中苯丙氨酸水平对于苯丙酮尿症来说具有临床参考意义。苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传病，是先天性氨基酸代谢障碍中最为常见的一种，新生儿疾病筛查是降低出生缺陷的有效措施之一，目前苯丙氨酸的检测方法有滤纸法、细菌抑制试验法、高效液相-质谱法等检测血液的苯丙氨酸。这些方法或者需要昂贵的仪器设备、或者耗时长、或者准确性差，需要更快速准确的检测方法。发现一种能与L-苯丙氨酸结合的适配体的检测方法非常适合于此。适配体具有灵敏度高、特异性强的特点，可以为苯丙氨酸的检测和苯丙酮尿症的临床研究提供新的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种适配体筛选方法，此筛选方法将核酶发生剪切作为过滤筛选条件，将一个具有剪切功能的核酶的茎部区域修改替换成一段例如为25～40个碱基长度的随机序列(例如将II类核酶的茎Ⅱ修改替换成30个随机碱基)，此时核酶结构被打破不能发生剪切，以此建立DNA文库；通过将整个DNA文库进行多轮的正负筛选，筛选出当目标配体(例如L-苯丙氨酸)加入后，可与目标配体结合的随机序列发生折叠，帮助核酶恢复完整结构，核酶可以发生自我剪切。分离筛选剪切片段，并经过PCR进行扩增。经过几轮筛选富集得到与目标配体结合的适配体。

在一个具体的实施例中，包括如下步骤：

步骤一：构建DNA文库，以II类核酶茎Ⅱ被替代后的序列II-random-library(如SEQ ID No.1所示)建立成为DNA文库；

步骤二：负筛孵育，将DNA文库于无目标配体的体系中孵育约12小时，筛选出不发生剪切的适配体；

步骤三：正筛孵育，在负筛孵育后收集得到的DNA文库中加入目标配体，孵育相应时间，经过筛选富集得到与目标配体结合的适配体；

步骤四：获取次级DNA文库；

步骤五：Illumina二代测序；

优选地，所述步骤二包括如下步骤：