[发明专利]一种检测乙肝病毒药物耐受相关突变gRNA及试剂盒

说明书

本发明提供了基于Cas14a1报告系统的检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶(DNA Polymera se)基因逆转录酶区(Reverse transcriptase,RT)药物耐受相关突变的引导RNA(guide RN A，gRNA)及试剂盒。gRNA的间隔序列为SEQ ID No.1～11、SEQ ID No.13～15、SEQ ID No.17～21或SEQ ID No.23～26任一所示的序列。通过在gRNA分子中的间隔序列(spac er)上引入与靶标序列的碱基错配，实现高特异性、快速检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶基因逆转录酶区(RT区)药物耐受相关突变。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶基因逆转录酶区(RT区)药物耐受相关突变的gRNA及试剂盒。

背景技术

全球有超过2.4亿人为乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染者。在未接受治疗的HBV慢性感染者中，有15％至40％进展为肝硬化，最终可能导致肝功能衰竭和肝癌。原发性肝癌(大约75％-90％的病例是肝细胞癌)是世界上第二大最常见的癌症死亡原因，在肝细胞癌病例中，HBV慢性感染者至少占50％。乙肝病毒是一种小的DNA病毒。感染性的病毒粒子以42nm的丹恩颗粒的形式循环，它包括一个由脂质双层和蛋白质组成的核衣壳，以及核衣壳内部3.2kb部分双链的HBV基因组。HBV基因组负链中有4个开放读码框，分别为S区、C区、P区、X区。P区负责编码HBV DNA聚合酶，其中逆转录酶区(reversetranscriptase,rt)编码具有逆转录酶活性的蛋白质。

治疗乙型肝炎的药物有两类：干扰素及核苷(酸)类似物(nucleos(t)ideanalogues,NA s)。目前治疗乙型肝炎的一线药物是NAs，包括L-核苷类药物：拉米夫定(lamivudine,LA M)、替比夫定(telbivudine,LdT)；烷基膦酸盐类药物：阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,A DV)、替诺福韦(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)；环戊烷类药物：恩替卡韦(entecavir,ETV)。核苷酸类似物(NAS)的靶标是HBV的逆转录酶，需要长期使用，以达到将病毒载量降低到无法检测到的水平和持续的病毒学应答的目标。HBV逆转录过程中由于缺乏严格的校正机制，核苷酸错配率高，随着时间的推移，在NAs的压力选择下，HBV rt区易发生突变，即基因型耐药突变，这些突变可能会使患者失去对这些药物的敏感性，导致对抗病毒药物耐药。与乙型肝炎病毒P基因逆转录酶区(RT区，其编码基因如SEQID No.28所示，氨基酸序列如SEQ ID No.29所示)耐药有关的最常见突变位点有RT区第169位、第180位、第181位、第184位、第202位、第204位、第236位、第250位氨基酸。

HBV耐药检测包括基因分型检测或表型分析。HBV耐药的表型分析依赖于细胞培养及相关技术，对劳动力和技术要求高，不适合进行高通量筛查。检测基因型耐药突变的方法有直接PCR测序、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment lengthpolymorphism,RFL P)、线性反向探针杂交法(inno-line probe assay,INNO-LiPA)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Timeof Flight Mass Spectrometry，M ALDI-TOF-MS)、实时荧光PCR溶解曲线分析、混合杂交测序PCR(微测序)、单基因组测序、DNA芯片技术、基因组深度测序等。这些方法快速、准确，但需要高昂的实验设备及训练有素的专业人员，也存在成本高、数据分析复杂等缺点，不适合临床推广应用。由于在HBV复制过程中自发变异率很高，以及治疗慢性乙型肝炎的多种核苷酸类似物药物的开发及长期使用，设计一种能够检测所有已知的耐药突变的分析方法越发重要。