[发明专利]一种用于发夹小RNA类药物定量的改进型茎环引物及其定量方法

权利要求书

1.一种用于发夹小RNA类药物定量的改进型茎环引物，其特征在于，所述改进型茎环引物具有6～9个未形成发夹结构的游离简并碱基(A/C/G/T)，6～9个所述游离简并碱基的具体序列以与目标发夹小RNA的中间环位置处形成互补配对为目的来设计，且所述改进型茎环引物的第一个3’端配对碱基距目标发夹小RNA 5’端大于18个碱基。

2.根据权利要求1所述的改进型茎环引物，其特征在于，所述改进型茎环引物的5’端是由如SEQ ID NO：1所示的碱基序列构成的茎环结构，3’端具有6～9个所述游离简并碱基(A/C/G/T)。

3.一种发夹小RNA的定量方法，其特征在于，采用权利要求1所述的改进型茎环引物进行检测。

4.根据权利要求3所述的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：采用所述改进型茎环引物对血浆或组织裂解液中的发夹小RNA进行反转录，获得目标cDNA，然后采用RT-qPCR引物进行RT-qPCR反应，获得所述目标发夹小RNA的定量结果。

5.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，反转录反应时采用温度梯度使所述改进型茎环引物的3’端与所述目标发夹小RNA的中间环位置处能够通过所述简并碱基进行成功配对，配对的所述简并碱基的数量为6～9个。

6.根据权利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述温度梯度具体为：95℃，5分钟；80℃，2分钟；70℃，2分钟；60℃，2分钟；45℃，2分钟，最后放置冰上。

7.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述RT-qPCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物含有4～6个随机碱基和12～16个与所述目标发夹小RNA 5’端相同的碱基，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

8.根据权利要求7所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的随机碱基序列的确定以调节引物的Tm值和GC含量为目的，使得Tm值为60±2℃，GC含量为40％～60％；所述正向引物与所述目标发夹小RNA互补的碱基序列为14个。

9.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，在RT-qPCR反应中以SYBR Green I作为染料进行定量检测。

10.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，可直接使用血浆或组织裂解液作为模板进行反转录和RT-qPCR反应，不需要进行核酸的提取。