[发明专利]一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用，包括如下步骤：使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核，利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体，使用带有滤膜的挤出装置反复挤出，即得脱核干细胞微囊泡。本发明中的方法在除去了干细胞的细胞核的同时保留了干细胞发挥促修复功能的关键蛋白质和RNA，降低了危险基因转移的风险。而且基于挤出法能够有效控制微囊泡的粒径分布，而且基于滤膜的孔径大小，灵活调整所制备的微囊泡的大小，并在组织损伤等方面具有显著治疗效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

由于受到各种生理/病理因素的影响，在很多情况下组织损伤无法实现理想的再生修复。究其原因，一方面在于组织损伤处的细胞往往存在老化甚至凋亡、坏死等异常情况；另一方面，损伤部位微环境严重失衡，长期处于炎症状态，细胞表型进一步恶化，正常修复进程被干扰打断。因此，逆转细胞老化，改善微环境，是实现组织高效快速修复的关键。

干细胞能够分泌多种促修复的生物活性因子，从而改善损伤处的微环境、激活组织修复相关的细胞，改善其生物功能性；此外，干细胞内部含有大量的活性线粒体，研究表明，干细胞能够通过纳米管、囊泡等，向损伤的、线粒体功能失调的细胞转运活性线粒体，从而恢复细胞活力，提高其产能水平，减少氧化应激的负面影响；干细胞还具有一定的免疫调节作用，因此，干细胞是组织修复领域最常使用的细胞之一。但相关技术中，研究发现将干细胞移植到组织损伤处以期望其能够进行组织修复时，发现干细胞很难长期停留在移植处并按照理想的方向分化，而且存在致癌致畸风险。而选择使用其他物质用于促进组织修复时，如干细胞分泌的细胞外囊泡，又存在着很多其他问题，如通过收集细胞培养上清、离心获得细胞外囊泡的方法需要培养大量的干细胞，步骤繁琐、成本高、产量低，收集到的细胞外囊泡粒径不均一、不可控等等。因此，极大地限制了干细胞在组织修复方面的实际使用。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用。本发明中的方法能够直接利用干细胞使其基于挤出法和具有特定孔径的滤膜的联用实现无核干细胞微囊泡的制备，相对于传统方法具有更显著的技术优势，且操作简单、成本低、产量高、囊泡粒径均一可控，具有极高的应用价值。

本发明的第一个方面，提供一种脱核干细胞微囊泡的制备方法，包括如下步骤：

使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核，利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体，使用带有滤膜的挤出装置反复挤出，即得脱核干细胞微囊泡。

在本发明的一些实施方式中，使用Percoll离心法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体。

在本发明中，发明人发现，如果直接将完整的干细胞进行挤出，细胞核中潜在的风险基因无法从制备的囊泡中除去，后续将囊泡应用在受损组织处时，存在一定的风险基因转移的可能。为了尽可能避免风险基因的转移，在挤出制备囊泡之前，将干细胞的细胞核从细胞中除去是十分有必要的。

在本发明中，除去细胞核后的胞质体仍然能够继续维持活性，且在除去核成分外，干细胞内的细胞器以及其他蛋白质大分子、RNA的成分基本不发生变化，这也为微囊泡在促修复等方面的应用提供了物质基础。

在本发明的一些实施方式中，所述干细胞包括人源干细胞和非人哺乳动物源干细胞。

在本发明中，对于干细胞的来源没有特别限制，包括人源干细胞和非人哺乳动物源干细胞，哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、猪、狗、牛、灵长类动物(除人外)等。

在本发明的一些实施方式中，所述干细胞根据功能性或阶段性包括但不限于：间充质干细胞、造血干细胞、iPS(诱导性多能干细胞)等。