[发明专利]具有3D微纳结构表面的毫米级固相微球及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，为惰性材料固体球，外表面形成若干三维立体凸起和/或凹陷组成的3D堆叠微纳结构，平均粗糙度为10纳米‑10微米，直径0.5‑20mm，其修饰有与靶分子/材料特异性结合的功能配基。本发明以陶瓷或玻璃等惰性固体球为基体，在其表面进行3D堆叠微纳结构改造并连接功能配基，获得一种可取代传统磁珠的检测材料，具有表面活性基团（如氨基、羧基等）丰度高，材料易得、成本低、操作简便、无需长时间集磁、不易漏集等优点,可替代传统磁珠应用在蛋白质纯化、免疫沉淀、核酸提取、细胞分离、高密度贴壁细胞培养等方面。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球及其制备方法和应用。

背景技术

在生物医学领域，部分实验需要将蛋白质，核酸等生物分子连接到固相材料上，以达到保留、富集或纯化的作用，使靶体分子与其他物质分离或者提高检测信号。行业应用中，常用的固相材料有聚苯乙烯、磁珠、硝酸纤维素膜等。通过在固相材料表面包被特异性抗体或受体等分子，用于分离纯化样品中的靶体的技术已被广泛应用于体外诊断、蛋白纯化、免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。

目前，生物医学领域最常用的固相材料就是磁珠。生物磁珠是指具有细小粒径的超顺磁珠，一般具有超强的顺磁性。在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。磁珠还具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性（磁力能驱动磁珠移动）又不会在水相中因重力自然沉降。在磁珠表面具有丰富的活性基团，以便和生化分子耦连，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

虽然，微纳磁珠拥有非常大的比表面积，能有效地提高生物配体分子间的结合（如:特异抗原抗体、生物素亲和素、酶底物、适配子(Aptamer)蛋白、核酸互补碱基对）数量，从而提高检测灵敏度，可应用于免疫学、生物化学或分子生物学等，但在实际使用过程中，磁珠必须依赖特殊的富集仪器、试验成本较高，磁珠结合靶体分子后，需要经过长时间的集磁操作后，聚集后的磁珠容易形成团聚复合物，必须在强外力作用下才能再次变成单分散的微球；在工业生产的大容量体系下，小粒径的磁珠需要非常长的时间才能完全集磁（特别是纳米级磁珠，其含磁量少，磁响应性更低），集磁不完全会发生磁珠流失并导致样本损失，检测结果不精密度增大，灵敏度降低，漏检率增加等问题。集磁是否完全直接影响分离样本的回收率，检测精密度，而完全集磁耗时很长，导致生产效率较低，也降低检测速度、通量等。

此外，常见的生物磁珠结构为4%的聚丙烯酰胺，4%的琼脂糖，或4%的聚苯乙烯等和7%-30%包裹在磁珠里面的氧化铁，磁珠表面修饰有特定的功能配基。磁珠制作工艺复杂，成本极高，特别是尺寸均一的微纳米级的磁微粒，难以大规模量产，磁珠生产技术一直是许多本土企业难以跨越的一项技术壁垒。由于固相材料在相同总体积/重量下，粒径越小，比表面积越大，越容易结合更多功能配基，因此人们通常将磁珠的粒径做到非常小。同时，为了保证磁珠具有足够大的比表面积、悬浮性、磁响应性，磁珠粒径一般维持在纳米级或微米级（常用200nm、800nm与 1um-3um）。这类成本高昂、小直径（微米、纳米级别）的磁珠在生物检测、体外诊断、蛋白纯化、免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等方面的应用研究，一直占据着主导地位，而对于大直径固相微球的研究则显得与主流研究或设计方向背道而驰。

发明内容

（一）要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，以廉价的陶瓷或玻璃球为基本材料，通过在陶瓷或玻璃球表面进行3D堆叠微纳结构改造并添加功能配基，获得一种可取代生物磁珠的新型材料，具有原材料易得、成本低廉、应用时操作简便、无需等待长时间集磁等优点。此外，本发明还提供了上述毫米级固相微球的制备方法和应用。

（二）技术方案