[发明专利]双功能萜合酶及其突变体以及催化产物

说明书

本发明涉及双功能萜合酶及其突变体以及催化产物。双功能萜合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。双功能萜合酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的改造对象双功能萜合酶FoFS同时具有异戊烯基转移酶结构域以及萜类环化酶结构域，兼具催化萜类合成前体DMAPP和IPP首尾相连和环化的双重功能。FoFS具有多个不同环系的二倍半萜产物。本发明通过改造FoFS，使突变蛋白能够催化其他复杂环系的二倍半萜化合物，对扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军具有重要意义。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其是涉及双功能萜合酶及其突变体以及催化产物。

背景技术

萜合酶是萜类化合物生物合成途径中一类重要的酶，负责将萜类线性前体环化形成具有不同环系及对映立体中心的结构。萜合酶复杂精密的催化决定了萜类化合物丰富多样的结构骨架。萜类化合物是自然界数量最庞大、种类最多、结构最为丰富的次级代谢天然产物，萜类化合物结构的复杂性和多样性，使其具备了广泛的生物活性。萜类化合物中不乏许多著名药物分子，如抗疟疾的青蒿素，抗肿瘤的紫杉醇，抗肝炎药物甘草酸等。

双功能萜合酶主要来源于真菌，同时具有异戊烯基转移酶(prenyltransferase,PT)结构域和萜类环化酶(terpene cyclase,TC)结构域，因此兼具萜类合成前体二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(isopentenyldiphosphate,IPP)首尾相连和环化的双重功能。目前为止，真菌来源双功能萜合酶的催化产物均为二萜和二倍半萜，且多为三环或四环。根据催化机制可知，PT结构域决定了催化合成萜类化合物的碳链长度，而TC结构域则对产物的环系骨架和立体构型起关键作用，且随着环化反应中间体上碳正离子的迁移，产物的环系结构也将逐渐趋于复杂。然而，由于高能碳正离子中间体的存在，环化过程瞬息万变、难以捕捉，也为双功能萜合酶催化机制的研究带来困难。同时，由于双功能萜合酶双结构域及多个柔性区域的存在，蛋白质晶体结构的获取和解析也十分困难，目前为止仍未有一例双功能萜合酶全酶晶体结构，即使是截短的TC结构域晶体也仅有一例，因此，该领域中关于酶的结构和功能关系的了解较为有限。但最近David W.Christianson等人用冷冻电镜解析了双功能萜合酶PaFS的结构，为双功能萜合酶结构的解析提供了新方案。

蛋白质工程方法包括定向进化、理性设计和半理性设计。由于双功能萜合酶蛋白晶体的不足，目前仍缺乏对其空间结构和功能关系的深入认知，理性设计无从下手，且成功率较低，因此并不适用。定向进化是常用的对酶蛋白进行改造和筛选的有效手段，但其随机突变的特性往往导致突变库过于庞大，具有成本高、效率低、周期长等弊端。近年逐渐发展起来的半理性设计采用生物信息学的手段，通过同源蛋白序列比对、蛋白空间立体结构的比较，同时参考已知催化机制等信息，理性选择蛋白质的改造靶点和替代氨基酸，从而构建较为精简的突变体文库，更有针对性地改造蛋白质。其中，定点饱和突变通过理性选择某一个氨基酸位点，将此位点的氨基酸突变成其他19种氨基酸构建定点饱和突变文库，定点饱和突变文库在快速、高效地探究蛋白功能和活性中心中发挥着重要的作用。因此，根据有限的双功能萜合酶结构和催化方面的信息，设计和构建高效突变体库，对更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，扩充萜类天然产物库，增添更多具有潜在药物价值的萜类化合物后备军具有重要意义。

发明内容

本发明的目的：提供双功能萜合酶及其突变体以及催化产物。

基于同源序列比对和蛋白模型构建，设计双功能萜合酶FoFS的突变位点，构建精简高效的突变库。通过萜合酶催化功能的改造和突变产物的获得，更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种双功能萜合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中，野生型双功能萜合酶简写为FoFS。