[发明专利]用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法，本发明的检测方法成本低、检测时间短，操作简单，相比于PCR检测，本申请的试剂成本不到市场荧光PCR法的二分之一，相比于霍乱弧菌分离与鉴定方法，精度更高，极大地降低了漏检率。本发明的试剂盒具有准确率高、特异性好、灵敏度高的特点，适合大规模生产和应用。

技术领域

本发明属于病菌检测技术领域，更具体地，涉及一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。共分为200多个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。目前,霍乱弧菌的检测多以传统细菌培养方法为主,存在着检出率偏低,费时费力等缺点，PCR已用于病原菌的检测，由于众多PCR方法的性能差异很大，不同PCR的检测能力参差不齐，且需昂贵仪器设备，成本高，且只能在设置齐全的实验室进行，实验时间长；环介导等温扩增(LAMP)方法的灵敏度接近或超过PCR，作为一种快速高效的实验方法，可肉眼观察判断结果，不依赖仪器设备就能实现现场快速检测，国内外还没有LAMP检测O1群霍乱弧菌研究报道。

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术检测O1群霍乱弧菌引物、试剂盒和检测方法，能够快速、准确检测O1群霍乱弧菌，以适合霍乱流行病学调查和现场检测。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法，能够快速、准确检测O1群霍乱弧菌，以适合霍乱流行病学调查和现场检测。

为实现上述目的，按照本发明的一方面，提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物，其特征在于，包括：

上游外引物F3：5’-CATTACCATTATCCATGGCC-3’，SEQ ID NO：1；

下游外引物B3：5’-GGCAAGTGGAATTATTTTTACCTTA-3’，SEQ ID NO：2；

上游内引物FIP：

5’-AGCACTTTTGACGAATAATATCGGAGACTTTCTCTCTTTATTTGGCTC-3’，SEQ ID NO：3；

下游内引物BIP：

5’-TGCCTGAATTTACAGGCTTACGCGATCGCCAACCCAAGTTGG-3’，SEQ ID NO：4；

反向环引物LB：5’-ATCACCACAATATGCACACACA-3’，SEQ ID NO：5。

进一步的，所述上游外引物F3和下游外引物B3用于识别O1群霍乱弧菌特异性检测基因的靶序列。

进一步的，所述上游内引物FIP、下游内引物BIP和反向环引物LB用于扩增O1群霍乱弧菌特异性检测基因的靶序列。

按照本发明的第二方面，提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的试剂盒，包括：引物混合液，所述引物混合液包括上述的引物。

进一步的，还包括：反应混合液、Bst酶、指示剂、阳性对照和阴性对照；

所述反应混合液包括：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Triton-X 100和dNTPs；

所述Bst酶包括：Bst 2.0DNA Polymerase；

所述指示剂包括：Calcein、MnCl₂和DMSO；