[发明专利]一种THDP依赖型脱羧酶及应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种THDP依赖型脱羧酶及其在制备呋喃铵盐前体中的应用，具体的应用是，上述脱羧酶能高效催化糠醛和甲醛C‑C键形成反应制备2‑呋喃基羟基甲基酮。本发明的脱羧酶由如下步骤制备获得：合成脱羧酶的编码基因，选择表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。本发明的脱羧酶具有极高的催化效率和底物耐受浓度，耐受的底物糠醛浓度的浓度可以达到60g/L，60g/L的糠醛浓度在20g/L的全细胞催化下6h之内可以反应完全，产物液相纯度能够达到97.26%，2‑呋喃基羟基甲基酮最高产量达到80g/L。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种THDP依赖型脱羧酶及其在制备呋喃铵盐前体中的应用。

背景技术

呋喃铵盐是临床上运用很广的抗生素头孢呋辛的关键中间体之一，头孢呋辛是一种非经胃肠给药的半合成广谱头孢素菌类抗生素。目前呋喃铵盐的主流生产工艺是采用乙酰呋喃为原料首先经过氧化制得呋喃酮酸，再经甲氧胺肟化、通入氨气成盐得到呋喃铵盐。而现在市场销售的乙酰呋喃基本采用糠醛脱羰基制得呋喃，再用醋酐酰化制备乙酰呋喃。乙酰呋喃的原材料价格较高，随着市场竞争越来越激烈，导致呋喃铵盐的产品利润逐渐下滑，价格由2020年的每吨30万元左右下滑至目前的每吨18万元左右。如果以糠醛为原料经过脱羧酶一步制得2-呋喃基羟基甲基酮，然后再通过化学氧化制得呋喃铵盐中间体呋喃酮酸，用2-呋喃基羟基甲基酮替代乙酰呋喃用于呋喃铵盐的生产将显著降低呋喃铵盐的生产成本。工艺路线如下 (酶催化糠醛制备2-呋喃基羟基甲基酮的示意)：

关于该工艺的相关报道，以下文献有过披露：

CN114591938A披露了一种羧化酶突变体及其制备方法和应用。其羧化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第492位氨基酸由Val突变为Pro得到。其以糠醛和甲醛为原料生产呋喃铵盐前体物质1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的高效催化，显著降低了呋喃铵盐的生产成本，产物1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮的纯度大大提高；其中，糠醛的浓度为20-60g/L，甲醛的浓度为20-60g/L，羧化酶突变体的用量为 8-12g/L；催化反应条件：温度为20-37℃，催化反应的pH＝6.0-80，催化反应的时间为8-20h。

上述专利文献CN114591938A所披露的方法，虽然最终获得的呋喃铵盐前体物质1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮纯度较高，但是催化的时间略长，比如，该文献中披露，要获得纯度为97.1％的1-(2-呋喃基)-2-羟基乙酮，需要反应20小时，反应时间较长。

发明内容

为了实现进一步提高催化效率和效果，缩短催化时间，本发明提供了一种能够更加高效催化糠醛与甲醛C-C键形成反应制备2-呋喃基羟基甲基酮的脱羧酶，相较于现有技术中的产品，其催化时间更短。

本发明中，利用分子克隆技术获得了脱羧酶的编码基因(SEQ ID NO:2)，通过构建该酶基因的6×His融合表达载体并导入基因工程菌OverExpress C43(DE3)中诱导表达，获得了酶蛋白。以脱羧酶为催化剂、以糠醛和甲醛为底物在适当的条件下进行酶催化反应，结果表明，该酶合成的2-呋喃基羟基甲基酮纯度高，能够达到97.26％以上，最高产量达到60g/L，在呋喃铵盐的工业生产中有巨大的应用潜力和价值，并且其催化时间仅仅为6小时，相较于背景技术中所提及的CN114591938A中所披露的羧化酶突变体，大大节省了催化时间、提高了催化效率。

本发明所提供的THDP依赖型脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码以上脱羧酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示。

包含上述核苷酸序列的表达盒、载体或重组菌，也同样在本发明所要保护的范围之内。

上述的脱羧酶的制备方法，具体包括如下步骤：合成脱羧酶的编码基因，选择表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。