[发明专利]一种自发性炎症性肠病斑马鱼模型及应用

说明书

本发明公开一种自发性炎症性肠病斑马鱼模型及应用，该方法利用CRISPR‑Cas9技术首次构建了trmt5敲除斑马鱼模型，该模型表现出稳定、可遗传的炎症性肠病样症状。该模型优势在于可以高效的获得大量的具有炎症性肠病症状斑马鱼，且具有良好的稳定性和重复性，可在一定程度上解决目前炎症性肠病模型中存在的建模周期长，费用高及成功率低等问题；此外，该模型可用于后续IBD研究及相关治疗药物开发和评估。

(一)技术领域

本发明涉及一种炎症性肠病模型的构建，特别涉及通过敲除斑马鱼的基因trmt5^-/-构建自发性炎症性肠病斑马鱼模型及应用。

(二)背景技术

炎症性肠病(IBD)是一种反复或慢性肠道炎症性疾病，表现出腹泻、便血、腹部不适和厌食症等症状，主要包括克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。CD通常累及小肠或大肠或两者均受累，并可能影响消化道的任何部位；而UC主要发生在结直肠。炎症性肠病好发于中青年，腹泻、黏液脓血便、腹痛等症状严重影响患者生活质量；其病因复杂，被认为是一种多因素疾病，主要由遗传、环境、肠道微生物群和免疫系统相互作用导致。由于此病难治愈、易复发、癌变风险高、往往需要终生服药，世卫组织将其列为现代难治病之一。因此，开展IBD的致病机制和药效学研究就显得非常有意义，动物模型在研究过程中扮演着不可或缺的角色。

在过去的几十年里，许多动物模型被开发出来用于研究IBD的发病机和评估潜在的治疗方式。根据已有的研究，IBD动物模型主要以哺乳动物为主，主要包括大鼠，小鼠，兔子和猪。而根据模型建立的方法不同，可以将其分为化学诱导模型和免疫/遗传诱导模型两大类。化学药物模型以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导最为常见，DSS作为结肠上皮的直接化学毒素，引起肠上皮细胞损伤和紧密连接的破坏，导致肠腔内细菌、其他抗原和促炎物质进入黏膜或黏膜下层，从而引发炎症反应；其他的化学诱导方法包括恶唑酮(OXZ)直肠给药和乙酸直肠给药等。化学诱导方法需要考虑动物个体差异，包括给药浓度和周期，另外环境因素对于药效也有一定的影响，因此往往需要多次摸索和调整才能找到合适的给药浓度和周期。相比之下，免疫/遗传诱导模型个体差异较小，其中小鼠CD4⁺CD45RB^High T细胞移植模型被称为UC的最佳表征模型，该模型核心原理是采用细胞分选技术从供体小鼠的脾脏中分离高浓度的CD4⁺CD45RB^High T细胞，移植到同基因型的免疫缺陷SCID或RAG-1^-/-小鼠体内，5-10周后即可引起受体小鼠出现消耗性疾病表现和结肠的弥漫炎症。此外，研究人员们还发现了一些遗传诱导的基因工程模型，如：白介素10敲除(Il10^-/-)小鼠、多药耐药基因1a敲除(Mdr1a^-/-)小鼠及中性粒细胞中STAT3特异性敲除小鼠(LyM^CreSTAT3^flox/flox)。然而这些基因工程小鼠模型的构建周期较长且花费较高。此外，以上小鼠IBD模型虽然可以模拟大部分人类IBD的特征，但是随着对IBD研究的深入，传统小鼠IBD模型的局限性逐渐出现，例如，不能连续观察肠道病理变化、难以进行活体成像、基因操作困难、以及正向遗传筛选和药物筛选困难等。

与小鼠相比，斑马鱼饲养简单、花费少、产卵量大、易于成像、易于基因操作，且具有与人类高度相似的胃肠道系统等特点，因此，斑马鱼或许可成为研究IBD和胃肠道疾病的另一有利模型。

(三)发明内容

本发明提供了一种自发性炎症性肠病斑马鱼模型及其构建方法与应用，所述模型通过敲除斑马鱼基因trmt5^-/-构建而成，敲除斑马鱼trmt5^-/-后的突变体在短时间内自发地表现出IBD样病理特征，并引起肠道炎症反应，提示该突变体是一个新的自发性炎症性肠病模型，为IBD的研究及相关治疗药物的开发和评估提供了良好的动物模型，并为线粒体损伤导致炎症性肠病发生提供了新的证据，提示线粒体相关基因可能是构建IBD动物模型的重要靶点；还可在一定程度上解决小鼠IBD模型构建周期长、花费高、成功率低、不能连续观察肠道病理变化及药物筛选困难等问题。