[发明专利]一种多通道活体显微成像系统及方法

说明书

本发明公开了一种多通道活体显微成像系统和方法。系统基于可见光多光子和近红外二区荧光共聚焦显微镜，该系统包括：飞秒激光器，滤光小孔，准直透镜，反射镜，长波通二向色镜，X‑Y扫描振镜，扫描透镜，筒镜，显微物镜，带通滤光片，荧光探测器。该方法包括：由单个飞秒光源以点激发的方式激发生物组织内的荧光物质，同时产生频率上转换和频率下转换荧光；荧光经系统多次分束，并同时接收；由振镜扫描每个像素点的信号并生成图像，将获得的图像按需求赋伪彩色并融合形成多通道图像。本发明相较于普通的多光子共聚焦显微镜而言，仅使用单个飞秒激光进行激发，且能够利用频率上下转换荧光同时进行成像，拓展成像通道，实现对组织内多个组分的同时成像。

技术领域

本发明属于应用光学的生物医学影像领域，涉及一种多通道活体显微成像系统及方法。

背景技术

共聚焦显微镜是一种三点共轭的特殊荧光显微镜。在激发光路上，平行的激光光束经物镜聚焦在样品的单点上；在探测光路上，被激发点发射出的荧光通过物镜后，在到达探测面前被再次聚焦到探测针孔，非焦点外的杂散荧光由于无法经过探测针孔而被滤除，使得探测器只接收目标点上的荧光，从而提高了成像的空间分辨率。共聚焦荧光显微镜大多利用荧光物质的频率下转换荧光，荧光波长一般大于激发光波长。

多光子显微镜中，荧光物质需要同时吸收多个较长波长的光子，发射出一个较短波长的光子，此过程为典型的非线性吸收过程，而双光子的吸收几率几乎是单光子吸收几率的亿分之一，因此双光子荧光成像只有在更高的能量密度下即焦点才能发生，由此在焦点处形成天然的针孔，实现了层析能力。

近红外二区（NIR-II，900-1880 nm）光相较于近红外一区（NIR-I，760-900 nm）在生物组织中具备更小的散射。并且，在部分波段中，生物组织具有较大的吸收，有助于吸收不利于成像的散射荧光，提高弹道光的比重，从而进一步提高组织深处的成像效果。

然而现有的商用多光子荧光共聚焦复合显微镜，多光子荧光成像系统和共聚焦荧光成像系统在时间上不能复用，即同一时间只能接收频率上转换的多光子荧光、频率下转换的共聚焦荧光两者之一进行成像；同时，系统的成像波段大多集中在可见光和近红外一区，未能充分利用生物组织中长波长光的散射抑制作用，因此在成像质量上仍有进步空间。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种多通道活体显微成像系统及方法。

本发明的系统包括：飞秒激光器，滤光小孔，准直透镜，反射镜，长波通二向色镜，X-Y扫描振镜，扫描透镜，筒镜，显微物镜，带通滤光片，荧光探测器。本发明方法包括：由单个飞秒光源以点激发的方式激发生物组织内的荧光物质，同时产生频率上转换和频率下转换荧光；荧光经系统多次分束，并同时接收；由振镜扫描每个像素点的信号并生成图像，将获得的图像按需求赋伪彩色并融合形成多通道图像。

具体的：

本发明的一方面提供了一种多通道活体显微成像系统，包括同轴依次设置的飞秒激光器（1），滤光小孔（2），准直透镜（3），反射镜（4）；沿反射镜（4）反射方向设置长波通二向色镜（19），

沿长波通二向色镜（19）的反射方向依次设置X扫描振镜（5）、Y扫描振镜（6）；沿扫描振镜（6）的反射方向依次设置扫描透镜（7），筒镜（8），长波通二向色镜（9），显微物镜（10），待测生物样本（11）；

沿长波通二向色镜（19）的透射方向依次放置长波通滤光片（20）、荧光收集透镜（21）、共聚焦小孔（22）、荧光探测器（23）；

沿所述长波通二向色镜（9）的反射方向设置长波通二向色镜（12）；

沿所述长波通二向色镜（12）的透射方向依次设置带通滤光片（13）荧光收集透镜（14）和荧光探测器（15）；

沿所述长波通二向色镜（12）的反射方向依次设置带通滤光片（16）荧光收集透镜（17）和荧光探测器（18）。

本发明的另一方面提供了一种多通道活体显微成像方法，具体步骤如下：