[发明专利]一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法

权利要求书

1.一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，步骤是：

(1)合成木糖醇-4-脱氢酶基因和L-海藻糖异构酶基因

木糖醇-4-脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或是与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

L-海藻糖异构酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，或是与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)构建重组质粒pET28a-xdh/L-fucI

将木糖醇-4-脱氢酶基因xdh连接到载体质粒pET28a的限制性酶切位点BamHI和HindIII之间，构建得到重组质粒pET28a-xdh；将L-海藻糖异构酶基因L-fucI连接到重组质粒pET28a-xdh的限制性酶切位点HindIII和Xho I之间，得到重组质粒pET28a-xdh/L-fucI；其中PCR克隆获得的L-海藻糖异构酶基因L-fucI所用上游引物含有核糖体结合位点AAGGAG；

(3)构建重组菌株

将重组质粒pET28a-xdh/L-fucI以1:10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴30min，再在42℃水浴中热击45s，立即冰浴2min，而后加入LB液体培养基中37℃，200rpm复苏1h，再将菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜；挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，得到重组菌株；其中，所述感受态细胞是E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)，得到的重组菌株相应是E.coliDH5-pET28a-xdh/L-fucI或E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI；

(4)诱导培养收集菌体

将重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.6，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，并将温度降低到25℃继续诱导培养12h；培养后的菌液10000rpm离心5min收集菌体；

(5)利用收集的菌体作为生物催化剂转化木糖醇生产L-木糖

将收集的菌体用50mM、pH 10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用底物溶液重悬菌体至OD₆₀₀为77-82构建生物合成L-木糖的反应体系，置于38-42℃恒温水浴锅中反应27-32h；其中，所述底物溶液由78-83g/L木糖醇、7.3-7.8mM Zn²⁺、50mMpH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制；将反应后的反应液于14000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，取上清液经0.22μm孔径超滤膜滤器过滤，滤液即为含L-木糖溶液。

2.根据权利要求1所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤(1)所述木糖醇-4-脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述L-海藻糖异构酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤(5)所述生物合成L-木糖的反应体系中木糖醇的浓度为79-81g/L，Zn²⁺的浓度为7.4-7.6mM，重组菌浊度OD₆₀₀为79-81，溶液为50mMpH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

4.根据权利要求3所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤(5)所述生物合成L-木糖的反应体系中木糖醇的浓度为80g/L，Zn²⁺的浓度为7.5mM，重组菌浊度OD₆₀₀为80，溶液为50mMpH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。