[发明专利]人类ND4基因重组载体在制备ND4蛋白试剂盒中的应用

说明书

本发明公开人类ND4基因重组载体在制备ND4蛋白试剂盒中的应用。通过全基因合成方法，合成核密码子编码的ND4核苷酸序列，构建人类ND4基因重组载体，将重组载体导入细胞后合成靶向线粒体的ND4蛋白，定位于线粒体并发挥功能。ND4基因重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明还公开了上述制备ND4蛋白的氨基酸序列，线粒体靶向序列，CMV启动子序列和表达载体序列。包括ND4蛋白制备方法与所用制剂。本发明所述人类ND4基因重组载体能在细胞中高效表达，制备的ND4融合蛋白能靶向线粒体，发挥正常ND4蛋白功能，缓解m.11778GA突变导致的ND4蛋白异常对细胞功能造成的影响。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及人类ND4基因重组载体在制备ND4蛋白的试剂盒中的应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种线粒体遗传病，呈母系遗传特点，主要表现为青年男性好发。临床表现多为双眼在数周至数月内，先后发生无痛性视力急剧下降至手动或光感，多数视力难以恢复，对患者的正常生活造成较大影响。LHON患者主要表现为眼部症状，少数可合并听力障碍，肌张力障碍等全身其他系统症状。

1988年Wallace首次发现Leber遗传性视神经病变与线粒体DNA的11778位点的突变相关。目前主要认为m.11778GA、m.14484TC、m.3460GA是LHON最主要的原发性致病突变位点。流行病学调查显示，不同人种的LHON患者三种原发性致病突变所占比例略有差异，但m.11778GA始终为占比最高的原发性致病突变，且该位点突变的患者预后最差。

m.11778GA主要影响线粒体复合体Ⅰ的ND4亚基，该位点突变导致复合体Ⅰ酶活力下降，进而影响线粒体的氧化磷酸化过程，使线粒体ATP生成减少，ROS水平增高，细胞凋亡增加，超过一定阈值时表现出相应的临床症状，最终导致患者RGC层变薄，视神经萎缩。

目前临床尚缺乏治疗Leber遗传性视神经病变的有效手段，辅酶Q₁₀、维生素C，活性氧自由基清除剂等药物可能对部分患者产生临床效果，但其疗效目前仍不明确。艾地苯醌作为辅助性治疗因子，目前认为可能仅对早期患者存在一定的治疗作用。目前，通过基因治疗技术，将突变蛋白的野生型基因导入细胞并进行正确的表达和定位，恢复线粒体功能，被认为是更具前景的LHON治疗方向。但该技术还存在基因表达效率过低，靶向性较差等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类ND4基因重组载体在制备ND4蛋白试剂盒中的应用。所述人类ND4基因重组载体的基因序列从N端到C端依次为CMV启动子，线粒体靶向序列COX8A-MTS和优化后的核密码子编码的人类线粒体ND4核苷酸序列。

本发明所述编码ND4蛋白的核苷酸序列为优化后的核密码子编码的人类ND4基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该载体能在突变细胞中表达野生型ND4蛋白，替代突变倒置的ND4一场蛋白，进而缓解由m.11778GA突变导致的Leber遗传性视神经病变。

本发明所述核密码子编码的ND4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明所述线粒体靶向序列COX8A-MTS如如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供一种人类ND4基因重组载体，重组载体包含ND4基因核苷酸优化序列，能导入细胞并正常表达靶向人类线粒体的ND4融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

优选的，所述重组载体的骨架载体为pAAV2-ZsGreen，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明所述与ND4基因位于同一阅读框，能验证ND4基因异位表达的Flag蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。