[发明专利]人类ND1基因重组载体在制备ND1融合蛋白试剂盒中应用

说明书

本发明公开了人类ND1基因重组载体在制备ND1融合蛋白试剂盒中应用。通过全基因合成方法合成核密码子编码的ND1核苷酸序列，构建人类ND1基因重组载体，将重组载体导入细胞后合成靶向线粒体的ND1融合蛋白并发挥功能。ND1基因重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。本发明还公开了上述制备的ND1融合蛋白的氨基酸序列，线粒体靶向序列，CMV启动子序列，表达载体序列，包含ND1融合蛋白制备方法及所用制剂。本发明所述人类ND1基因重组载体能在细胞中高效表达，制备的ND1融合蛋白能靶向线粒体，发挥正常ND1蛋白功能，缓解m.3460GA突变导致的ND1蛋白异常对细胞功能造成的影响。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及人类ND1基因重组载体在制备ND1融合蛋白试剂盒中应用，是制备缓解m.3460GA突变导致的Leber遗传性视神经病变的ND1融合蛋白试剂盒。

背景技术

线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，其氧化磷酸化产物ATP是生命活动主要的能量来源。ND1蛋白是线粒体呼吸链复合体Ⅰ的重要组成亚基，编码ND1蛋白的线粒体基因突变导致蛋白氨基酸序列改变，常引发细胞能量代谢异常并导致疾病发生。

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是以双侧无痛性、急性或亚急性中央视野缺失和视力衰竭为特征的退行性视力障碍，儿童至老年均可发病，青年及男性好发，发病年龄通常集中在20-30岁，患病个体发病前通常不表现其他症状，多数患者视力下降至0.1以下。

Leber遗传性视神经病变由线粒体位点致病突变引起，呈母系遗传特点，目前国内由于基因突变导致的LHON患者中，90％～95％LHON与三种常见的线粒体致病突变相关，即m.3460GA、m.11778GA、m.14484TC，其中3460位点突变占1％左右，第3460位点核苷酸突变导致ND1蛋白丙氨酸变为苏氨酸，导致复合体Ⅰ活性下降，视神经细胞ATP产生降低，从而导致细胞凋亡，患者出现LHON疾病且预后不佳。

LHON目前主要以支持性治疗为主，尚无有效的治疗方法。但随着近年来基因治疗技术的发展进步，通过将重组腺相关病毒药剂注入眼玻璃体腔内感染视神经细胞，将外源野生型正常蛋白导入线粒体发挥作用。现有技术CN 110724695A公开了一种编码重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白(ND1)基因及其表达载体的构建方法，其大小为2460bp，引导ND1蛋白进入线粒体中。但该技术还存在靶向性不高，从而影响融合蛋白表达及治疗效果的缺点，还有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供人类ND1基因重组载体在制备ND1融合蛋白试剂盒中应用，所述人类ND1基因重组载体的基因序列从N端到C端依次为CMV启动子、线粒体靶向序列COX8A-MTS和优化后的核密码子编码的人类线粒体ND1核苷酸序列。

所述人类ND1基因重组载体的核苷酸序列为优化后的核密码子编码的人类ND1基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该载体能在突变细胞中表达野生型ND1蛋白，替代突变导致的ND1异常蛋白，进而缓解m.3460GA突变导致的Leber遗传性视神经病变。

优选的，所述核密码子编码的ND1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述线粒体靶向序列COX8A-MTS如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

试剂盒通过提供高效靶向人类线粒体的ND1基因重组载体，在细胞中表达ND1融合蛋白并准确定位至线粒体发挥功能，从而为缓解m.3460GA原发性突变导致的Leber遗传性视神经病变提供能优越的治疗手段，解决现有技术中重组载体无法正常翻译ND1蛋白，蛋白表达效率低且靶向性不高等技术问题。