[发明专利]一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物组合和探针及其应用

说明书

本发明公开了一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，涉及动物卫生技术领域。具体地公开了用于检测蜜蜂亮热厉螨的引物对，所述引物对为特异性扩增COI基因或含有所述COI基因片段的一对引物，所述COI基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。本发明利用收集的多株亮热厉螨进行DNA扩增和序列分析比对，筛选核酸保守序列作为靶目标，开发了用于检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及实时荧光PCR检测方法。本发明的引物探针组合物及其检测方法灵敏度高，最低检测限为2.8拷贝/μL，并且特异性好，与其他蜂螨均无交叉反应，可用于蜜蜂亮热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫。

技术领域

本发明涉及动物卫生技术领域，具体涉及一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。

背景技术

亮热厉螨(Tropilaelaps clareae)属于节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜱螨亚纲(Acari)寄螨总目(Parasitiformes)中气门目(Mesostigmata)皮刺螨总科(Laelapidae)热厉螨属(Tropilaelaps spp)，是亚洲地区蜜蜂科(Apidae)昆虫的重要害螨，该螨以吸食蜜蜂封盖子的血淋巴为生，引起大量封盖幼虫和蛹变形或死亡，出房工蜂体型畸形和其他生理缺陷，整个蜂群的生产力严重下降，如果控制不力就会导致整个蜂群的死亡。亮热厉螨发育周期短且适应蜜蜂生长发育的条件，种群增长很快，而且可以作为病毒载体，传播蜜蜂病毒病，已成为一种比大蜂螨危害性更大的蜜蜂体外寄生虫。

由于亮热厉螨主要危害亚洲地区饲养的西方蜜蜂蜂群，并未对其它地区蜜蜂蜂群造成影响，所以未受到西方国家的重视，关注度相对较低，基础研究滞后。目前对于亮热厉螨的检测主要采用形态学方法，结合临床症状，通过开盖检查和箱底检查。由于对亮热厉螨各个级型的形态和生活史并不完全清楚，而且成年亮热厉螨出现在寄生蜂群的子脾表面且行动灵活，蜂螨体色与蜡脾颜色接近，易形成体色伪装，增加了亮热厉螨的发现及收集的难度，所以仅靠形态学检查无法准确鉴定。而基于基因组诊断方面的技术目前尚无相关报道，有必要开展相关分子水平诊断计算的探讨，鉴于此，研究和开发检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于蜜蜂亮热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何简单、快速、灵敏和/或特异地检测蜜蜂亮热厉螨(Tropilaelaps clareae)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的引物对，所述引物对可为特异性扩增蜜蜂亮热厉螨线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase subunit I,COI)基因或含有所述COI基因片段的一对引物，所述COI基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。

进一步地，所述引物对由引物TCL_F和引物TCL_R组成，所述引物TCL_F可为SEQ IDNo.2所示的单链DNA分子；所述引物TCL_R可为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。

所述引物TCL_F为正向引物，所述引物TCL_R为反向引物。

所述正向引物TCL_F和反向引物TCL_R为特异性扩增蜜蜂亮热厉螨(Tropilaelapsclareae)的COI基因的引物对，即用于检测蜜蜂亮热厉螨的特异引物对。

本发明还提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的组合物(引物探针组合物)，所述组合物可由所述引物对和蜜蜂亮热厉螨特异性探针组成，所述蜜蜂亮热厉螨特异性探针可为与所述COI基因特异结合的单链DNA分子CAGATTACCYGTCCTAGCTGCAGCT。

所述探针可为TaqMan探针，名称为TCL_P。