[发明专利]一种Ⅺ型新城疫病毒（F48E9）的重组拯救病毒制备方法、重组病毒及应用

权利要求书

1.一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法，包括如下操作步骤：

(1)Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)基因组全长cDNA转录载体的构建：

在质粒pBR322中构建了Ⅺ型NDV F48E9毒株基因组的全长cDNA，质粒命名为pBR322-rF48E9；

(2)Ⅺ型新城疫病毒反向遗传系统的建立：

根据Ⅺ型NDV F48E9毒株全长感染性克隆载体pBR322-rF48E9的序列，设计构建P蛋白不同氨基酸位点突变为丙氨酸(A)的载体所需引物；构建完成的质粒命名为pBR322-rF48E9/P(*A)；

(3)Ⅺ型新城疫病毒P蛋白氨基酸点突变重组病毒的制备：

将质粒pBR322-rF48E9、pBR322-rF48E9/P(*A)分别与pCI-NP、pCI-P和pCI-L、pCAGGS-T7共转染BHK-21细胞(仓鼠肾细胞)，转染后3-4天收集细胞上清液接种9-11日龄SPF鸡胚的尿囊腔，成功收获重组病毒rF48E9/P(*A)及对照病毒rF48E9。

2.根据权利要求1所述的一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法，其特征在于，步骤(2)不同氨基酸突变点为³⁸⁶R或³⁸⁷K；经步骤(3)制备收获重组病毒rF48E9/P(R386A)或重组病毒rF48E9/P(K387A)。

3.根据权利要求1所述的一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法，其特征在于，步骤(1)cDNA转录载体的构建方法包括如下操作步骤：

(1)去除质粒pBR322的AscI和Rsr II位点之间的片段并用122nt寡核苷酸连接子取代；将84ntδ型肝炎病毒(HDV)抗基因组核酶序列和T7 RNA聚合酶转录终止信号插入连接子的下游端；

(2)NDVF48E9感染的鸡胚尿囊液提取RNA，通过RT-PCR产生完整的15192nt基因组的全长cDNA；基因组全长被构建为8个片段，分别在NP、P、M、F和HN基因3’非翻译区(3’-UTR)创建6个限制性内切酶位点Pme I、Pac I、AsiS I、NotI和SnaBI；在L基因中创建SpeI和Sac II 2个酶切位点；通过重叠PCR删除HN和L基因序列上的RsrII酶切位点；

(3)上述片段依次克隆到pBR322质粒的T7启动子和HDV抗原组核酶序列之间，得到质粒pBR322-rF48E9。

4.一种Ⅺ型新城疫重组病毒，其特征在于，采用如权利要求1-3中任一项所述的制备方法制得。

5.根据权利要求4所述的Ⅺ型新城疫重组病毒，其特征在于，是将Ⅺ型新城疫病毒P蛋白³⁸⁶R氨基酸或³⁸⁷R氨基酸点突变为丙氨酸得到的重组病毒。

6.根据权利要求5所述的Ⅺ型新城疫重组病毒，其特征在于，Ⅺ型新城疫病毒P蛋白³⁸⁶R氨基酸点突变由精氨酸突变为丙氨酸(A)，得到重组病毒rF48E9/P(R386A)；

Ⅺ型新城疫病毒P蛋白³⁸⁷K氨基酸点突变由赖氨酸突变为丙氨酸(A)，得到重组病毒rF48E9/P(K387A)。

7.根据权利要求6所述的Ⅺ型新城疫重组病毒，其特征在于，重组病毒rF48E9/P(R386A)的P蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.2所示；重组病毒rF48E9/P(K387A)的P蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。

8.如权利要求4所述的Ⅺ型新城疫重组病毒在新城疫抗体或疫苗筛选或评估中的应用。