[发明专利]2-肼基对苯二甲酸在水果过敏原糖链决定簇分析中的应用

说明书

本发明公开了2‑肼基对苯二甲酸作为MALDI反应型基质在水果过敏原糖链决定簇分析中的应用。2‑HTA具有肼基活性基团，作为反应型基质容易与还原糖半缩醛反应，可显著提高电离化效率；同时，2‑HTA作为基质可辅助糖类离子化，因此过量的2‑HTA无需分离。此外，2‑HTA的双羧基基团有利于糖链衍生化产物在负离子模式下去质子化，单一的离子化形式在集中并增强信号强度的同时形成了易于归属的质谱图。SA为有机酸，可极大地催化成腙反应的进行；同时SA作为传统MALDI有机基质可促进其离子化。此外,具备不同酸碱度的SA与2‑HTA的组合使用可显著改善样品结晶均匀度，提高了糖链定量检测的准确性。

技术领域

本发明涉及糖生化分析领域，具体涉及2-肼基对苯二甲酸反应型基质在MALDI质谱中对水果过敏原糖链决定簇分析中的应用。

背景技术

流行病学调查表明，全球约有6％～13％的人对食物产生过敏反应。近年来过敏性疾病发病率呈现快速增长的态势，已成为全球重点关注的食品安全问题之一。水果是我国主要过敏食物之一，水果过敏与人体遗传、环境和水果种类等多因素相关，常与花粉过敏发生交叉反应，是影响农产品安全的突出问题。引发过敏反应的水果种类多样，蔷薇科水果尤为突出。

糖基化是最为常见的蛋白质翻译后修饰类型之一，糖蛋白占细胞总蛋白的50％以上。根据连接方式，主要分为N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化等类型。其中，N-糖基化是蛋白质糖基化的主要形式，寡糖链通过酶促反应特异性连接在蛋白序列主要为Asn-X-Ser/Thr(NXS/T)的天冬酰胺残基上(其中X为除脯氨酸之外的任意氨基酸)。N-糖基化修饰对蛋白质的免疫识别和应答机制，对于植物糖蛋白的致敏性有重要影响。

1981年Aalberse RC等人首次研究了糖蛋白与过敏的关系，发现植物性食品、花粉等的糖蛋白可以被IgE识别。由此，研究者开始探索蛋白质糖基化与过敏之间的关系。研究发现，蛋白上的糖链可以引发特定的免疫反应，其中以N-糖链为主。Weber A等人于1987年发现蛋白质上的N-糖链是IgE识别的表位。Tretter V等人1993进一步发现N-糖蛋白所连接的α-1,3-岩藻糖是IgE识别的抗原决定簇。Wilson等人于1998年发现了植物N-糖链中的核心α-1,3-岩藻糖是抗体识别的重要位点。Ree等人于2000年发现了核心α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖是结合IgE最为频繁的糖类表位。最近，国际免疫学会联合会(IUIS)下属的过敏原命名专门委员会(Allergen Nomenclature Sub-Committee)正式将糖链作为过敏原(http://www.allergen.org/carboep.php)。

糖链决定簇的高灵敏度定性定量分析对过敏相关研究具有重要意义。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)被广泛应用于蛋白N-糖链的分析，但电离化效率差限制了MALDI在该类物质检测中的广泛应用。2,5-二羟基苯甲酸(DHB)是最常用的N-糖链检测基质，但其与分析物共结晶不均匀，重现性差，检测灵敏度有限。为了提高N-糖链电离化效率和检测效果，通常需进行衍生化，如甲基化、还原胺化、非还原胺化等，其中非还原胺化结合靶板衍生化可以很好地兼容MALDI质谱的高通量特性。前人开发的3-氨基喹啉、2-苯基-3-(对-氨基苯基)丙烯腈、2,5-二羟基苯甲酰肼等常用于正离子模式动物或人体样本蛋白N-糖链的检测，虽在一定程度提高了检测的灵敏度，但难以满足水果过敏原N-糖链的高灵敏检测需求。与动物相比，果实样本背景复杂，色素、脂质等杂质常给分析造成干扰。此外，果实样本中蛋白质含量很低，蛋白N-糖链的高灵敏定性定量仍然具有挑战。

针对以上问题，设计和开发基于新型MALDI反应型基质的水果过敏原糖链决定簇分析策略对于过敏相关研究具有重要的价值。

发明内容