[发明专利]一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜及其制备方法

权利要求书

1.一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

（1）采用乙醇梯度脱水法将一种或多种生长因子载入明胶微球中，将明胶微球与聚合物溶液混合均匀，作为壳层溶液；

（2）将明胶溶解于混合溶剂中，充分溶解后，加入一种或多种生长因子，搅拌均匀，作为核层溶液；

（3）将核层和壳层溶液分别装入不同注射器，采用同轴静电纺丝技术制备得到核层负载一种或多种生长因子，壳层负载另一种或多种生长因子的核壳纤维膜，真空干燥，去除残留溶剂；

（4）运用静电层层自组装技术将一种或多种生长因子负载到核壳纤维膜的外表面；

（5）冷冻干燥得到一种以不同速率次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜。

2. 根据权利要求1所述的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用乙醇梯度脱水法制备载生长因子的明胶微球，在室温下将明胶溶解于去离子水中，直至得到澄清溶液，其质量浓度为10~60 mg/mL，使用 0.2mol/L 氢氧化钠调节溶液 pH 值至 7.0~7.4，搅拌条件下加入乙醇梯度置换出水以形成明胶颗粒，再加入乙二醛进行交联，室温下搅拌10~20 h；反应结束后使用12 %(w/v)的焦亚硫酸钠水溶液除去乙二醛中未反应的醛基；在 14000rpm下离心 90min，将收集到的明胶颗粒用去离子水洗涤两次后，冷冻干燥；为了负载生长因子，使明胶颗粒的羧基在N-乙基-N`-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC，4 mg/ml)和 N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠(NHS，4 mg/mL)的 MES缓冲液(100 mM，pH 6)中活化 1~3h；在去离子水中透析过夜后离心，冷冻干燥，再加入到生长因子溶液中，反应10~20h；离心收集，冷冻干燥；其中，在 100ml 的最终洗脱混合液中，乙醇与水的体积比为13：7~7：13。

3.根据权利要求1所述的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤1中，微球制备材料为天然高分子材料，如明胶、壳聚糖、透明质酸等；

壳层材料为合成高分子材料，如聚乳氨酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯等，分子量为10~30万，质量浓度为5~20 %(w/v)，溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇等的一种或多种混合。

4.根据权利要求1所述的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤2中，核层材料为天然高分子材料，如明胶、壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇、胶原蛋白等，核层材料的溶剂为去离子水、磷酸盐缓冲液、醋酸等水性溶剂，或水性溶剂与有机溶剂按照不同配比制备的混合溶剂；配制不同浓度的核层材料溶液，质量浓度为10~20 %(w/v)，混合溶剂体积比为有机溶剂：水性溶剂= 1:3~3:1。

5.根据权利要求1所述的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤2中，核层溶液中加入的生长因子为一种或多种，也可以为多肽等生物活性物质，其质量浓度为10~20 μg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤3中，采用同轴静电纺丝技术制备核壳纤维工艺参数为：温度20~30℃，相对湿度35~45%，核纺丝液流速0.0005~0.001 mm/s，壳纺丝液流速0.0025~0.003 mm/s，负电压15~20 kV，接收距离10~20 cm，真空干燥的温度为30~37℃，时间为24~48h。

7.根据权利要求1所述的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤4中，采用层层自组装 技术制备负载生长因子纤维膜时：生长因子工作液的浓度为10~20 μg/mL，溶剂为水、PBS缓冲液等；采用与壳层材料带相反电荷的水溶性材料发生自组装反应，如壳聚糖、透明质酸、胶原等，其浓度为1~5 mg/mL，pH为3~5；

纳米纤维膜小片在不同溶液中浸泡的时间为10~20 min，整个浸泡过程均在-4℃条件下进行，自组装层数为一层或多层。