[发明专利]FUS蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法

说明书

本发明公开了一种FUS在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达和纯化方法，重组蛋白包括：编码FUS的核苷酸序列的第一核酸元件；编码能够被酶或化学方法切割的核苷酸序列的第二核酸元件；编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件。其表达方法包括：扩增核酸片段、制备重组质粒、转化至农杆菌、扩大培养、注射至植物叶片。纯化方法包括透析、聚集、重溶、切割等。本发明首次利用FUS作为融合标签，在植物中表达重组蛋白，FUS融合蛋白可以在叶片中形成蛋白颗粒，使形成的蛋白聚集在一起，从而减小蛋白对植物细胞的毒性，延长植物生产该蛋白的周期，增大产量。纯化可通过控制pH使其分离，方法简单，纯度高，成本低。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种FUS蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法。

背景技术

利用植物生物反应器来大规模生产重组蛋白或多肽已被证实为富有前景的系统，相较于传统微生物和哺乳动物生物反应器，植物生物反应器有着低成本、高产量、风险低、规模化容易等优势，已经有多种有价值的重组治疗蛋白或非药用蛋白在植物中表达并得到商业化应用。为了进一步发展植物反应器，来自植物样品的目标蛋白的下游纯化(估计占治疗蛋白情况中生产成本的80％)，是植物生物反应器大规模工业生产重组蛋白中的关键因素。

传统的蛋白纯化方法涉及以融合有亲和标签的融合形式表达目标蛋白，亲和标签包括多聚组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、c-myc、strepII、钙调蛋白结合肽等。已出现若干种简化下游蛋白纯化的新策略。油质蛋白(oleosin)融合使所需蛋白质靶向至可从水溶性部分容易分离的油体。疏水蛋白(hydrophobin-I，HFBI)融合改变融合蛋白的疏水性，有利于通过基于表面活性剂的两相系统的纯化。融合有γ-玉米醇溶蛋白结构域(Zera)使重组蛋白形成紧密、ER-定位的蛋白颗粒(protein bodies，PBs)。类弹性蛋白(ELP)由重复的五肽(VPGXG)(X是除脯氨酸外的任何氨基酸)组成，具有温度敏感性相变性质。当温度升高至其转变温度(Tt)时，可溶性ELP会聚集成不可溶相，通过离心即可沉淀分离。当添加冷缓冲液时，可使聚集的ELP重溶并回复到可溶相。上述Zera、ELP和hydrophobin-I三种标签都含有疏水区，有利于标签及其融合蛋白通过自组装的方式形成PBs(Plant Biotechnol.J.2017.15:671–673)。

渐冻人症关键致病蛋白FUS(Fused in sarcoma)在转录调控、RNA代谢和DNA损伤反应中起到关键作用。FUS突变与肌萎缩侧索硬化症(ALS)和罕见的额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia,FTLD)相关。FUS氨基端低复杂度的类朊病毒样结构域(prion-like LC domains)可在无细胞培养基中通过液-液相分离形成高度可逆的纤维状淀粉样蛋白。外界压力刺激或疾病相关突变会促使相关致病蛋白动态相分离调控紊乱，导致蛋白进行液-固相转化并产生高度稳定的致病淀粉样聚集体。这种高度稳定的病理性淀粉样聚集体的产生和传播与相应疾病的发展密切相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种FUS蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法。由于FUS蛋白具有液-液相分离及自组装特性，本发明首次利用FUS蛋白作为融合标签，在植物中表达重组蛋白，我们发现FUS蛋白融合蛋白可以在烟草叶中形成蛋白颗粒，使形成的蛋白聚集在一起，从而减小蛋白对植物细胞的毒性，延长植物生产该蛋白的周期，增大产量。纯化时可通过控制pH使其分离出来，方法简单，纯度高，成本低。

为了实现上述目的，本发明提供了一种FUS蛋白在作为融合标签中的应用。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白，包括：

a)编码FUS蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；

b)编码能够被酶或化学方法切割的核苷酸序列的第二核酸元件；