[发明专利]用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用

说明书

本申请涉及一种用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用。所述参考品为重组酵母工程菌，且重组酵母工程菌的染色体上整合有外源的靶病原体基因；所述外源的靶病原体基因随着重组酵母工程菌的染色体稳定遗传。该参考品在结构、性能和成分等各种方面基本接近于待检测的相应病原体的临床样本或培养物，可以充分模拟真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等较难破壁的病原体，且所述参考品的制备方法具有操作简单，制备周期短、生成量大、生产成本低、来源和性能足够稳定，使用时可监测样本从处理到检测的全过程，最重要的是能够模拟不易获得的病原体难破的细胞壁，且具有较高的生物安全性，可较好地应用于检测病原体的分子诊断产品中。

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用。

背景技术

难破壁病原体包括真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等病原体。其中真菌是一种真核生物，通常分为三类，即“酵母菌”(单细胞真菌)、“霉菌”(丝状真菌)和“蕈菌”(大型真菌)。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤藓菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌、烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，多数常发生于免疫力低下的患者，引起全身散播性感染，影响预后。目前，已发现了至少150种真菌可使人类致病，侵犯人体的各个脏器。深部真菌病的死亡率仍很高，即使救治成功也需花费大量的经济代价。有资料表明，因真菌感染而死亡的患者能获得生前诊断的不足20％。因此，对真菌快速准确的诊断和鉴定病种，进而对于指导用药是十分重要的。

目前，真菌感染的常规实验室诊断主要包括真菌涂片、培养、鉴定、药敏试验、血清学鉴定等。这些常规传统的检测方法存在耗费时间而且干扰因素多，而且它们的敏感性和特异性有限。以PCR方法为基础的分子生物学技术已在临床微生物检测领域引起了一场革命。以真菌核酸PCR检测方法成为了真菌感染的最佳诊断工具之一，因此有望研制出各种商品化的真菌快速分子诊断鉴定试剂盒，为临床提供新的快速早期诊断手段，对于指导临床用药和预后评估都有重要的意义。而在分子诊断产品开发过程中，从反应体系的建立，到产品性能的验证，直至定型产品的质控都离不开参考品，试剂盒的质控体系是通过设置各种质控品来实现。由于有些临床样本或培养物的生物传染性及来源有限，如何建立合适的参考品，能充分的模拟真菌是关键。另外，由于真菌细胞壁较厚，结构坚韧，其破壁难度较细菌细胞大，适用于细菌细胞的破壁方法用于真菌细胞破壁的效果不佳。

比真菌更难破壁的分枝杆菌(结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌及非结核分枝杆菌NTM)，其细胞壁含有大量酯类，干重占比60％。人结核分枝杆菌在干燥痰液中可存活6～8月，通过呼吸道、消化道或皮肤粘膜损伤进入机体，引起肺脏或其它脏器病变。牛型结核分枝杆菌对牛和其它家畜有致病性，能引起牛、马、猪的进行性和致死性结核病，对绵羊和山羊也能引起进行性结核病，对人特别是儿童易感，绝大多数病例受害部位为淋巴结和腹腔器官。许多非结核分枝杆菌菌株为条件致病菌，对常用的异烟肼、链霉素等耐药，但对利福平有一定敏感性，非结核分枝杆菌经治疗后也常出现L型，耐药性增高，有的经多年治疗不愈，且L 型往往因细胞壁脂质缺失不易致敏淋巴细胞，结合素试验可呈阴性。近年来，非结核分枝杆菌病也呈快速增多趋势，播散性的NTM病可侵犯全身多个器官，最常受累器官为肝、淋巴结、胃肠道，其次为肺、骨髓、心、肾亦可累及，NTM病已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题之一。