[发明专利]一种检测携Clb毒素大肠杆菌荧光探针的合成与应用

说明书

本发明公开了一种检测携Clb毒素大肠杆菌荧光探针合成与应用，该荧光探针的化学结构式如下。本发明设计构建了一种红光发射的荧光探针，能够快速且高选择性地检测携Clb毒素大肠杆菌。该探针能借助荧光强度的变化，在不同的质粒构建大肠杆菌ClbP表达的条件下，能快速直观的优化筛选出最佳表达途径；同时该探针也可实现对携Clb毒素大肠杆菌的比色荧光双信号响应，选择性好，灵敏度高。在分析化学、生命科学、生物医疗等技术领域有着巨大的应用前景。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种用于检测携Clb毒素大肠杆菌荧光探针的合成与应用。

背景技术

大肠杆菌B2亚型产生的Clb毒素可破坏肠上皮细胞的DNA，增大结直肠癌患病风险。因此，检测Clb毒素能对结直肠癌的早期预警具有重要意义。然而，由于Clb毒素结构复杂，迄今为止，尚无法纯化及确定其确切的结构。但是，在细菌内膜周质中存在一种名为ClbP的肽酶，该酶参与Clb毒素的生物合成，通过催化水解无生物活性的Clb毒素前体化合物产生生物活性物质Clb毒素，相对Clb毒素而言，能稳定存在（Nat. Microbiol. 2016, 1,15009；Nat. Prod. Rep. 2015, 32, 1534-1540；Nat. Chem. Biol. 2017, 13, 1059-1061；J.mol. Biol. 2012, 424, 203-214；Science. 2006, 313, 848-851）。因此，利用ClbP能专一性催化水解产生Clb毒素这一特性，能建立一种灵敏、简单、选择性好的方法对ClbP进行检测，进而实现对Clb毒素检测及对携Clb毒素大肠杆菌的识别筛选具有重要的价值和意义。

近年来，荧光探针因选择性好、灵敏度高、操作简便且能够检测和可视化活细胞中的生物分子而受到广泛的关注。截至目前，已报道了一些荧光探针用于检测ClbP（Org. Lett.2019, 21, 4490-4494；ACS Chem. Biol. 2019, 14, 1097-1101）。但是，这些工作都以香豆素衍生物为荧光响应单元，设计合成对ClbP荧光响应的化学传感器，它们发射波长都处在短波长区，无法避免生物自发荧光的干扰，自身荧光猝灭以及短波长光毒性等问题；目前也没有将ClbP和携Clb毒素大肠杆菌关联起来，作为一个整体进行检测分析。

发明内容

鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红光发射的荧光探针，具体涉及对ClbP的检测，进而实现对携Clb毒素大肠杆菌检测荧光探针的合成与应用；同时，还通过荧光强度，对不同质粒构建大肠杆菌ClbP表达，实现快速直观的优化筛选。其本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、成本低、高选择性和高灵敏的上述荧光探针的合成与应用方法。

本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种用于检测携Clb毒素大肠杆菌荧光探针的合成与应用，其探针的化学结构式如下：

。

一种检测携Clb毒素大肠杆菌荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1.合成叔丁基(S，E)-(3-氰基-1-((4-(2-(4-氰基-5-(二氰基亚甲基)-2，2-二甲基-2，5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯

．将适量的(E)-2-(4-(4-氨基苯乙烯基)-3-氰基-5，5-二甲基呋喃-2(5H)-亚乙基)丙二腈，N-Boc-D-天冬酰胺，HATU和DIPEA加入二氯甲烷溶液中，室温反应2-10h；乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，柱层析纯化得暗红色的固体；