[发明专利]一种人外周血干细胞提取方法及应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种人外周血干细胞提取方法及应用，人外周血干细胞提取方法包括如下步骤：(1)：取新鲜抗凝血与羟乙基淀粉550混合，加入环孢菌素A，得混合液；(2)：向步骤(1)所得的混合液中加入全血及组织稀释液，混匀，沉降，取上清液；(3)：向步骤(2)所得的上清液中加入细胞洗涤液，混匀，离心，弃上清液保留沉淀细胞；(4)：向步骤(3)所得的细胞沉淀中加入全血及组织稀释液形成混合液，调整细胞浓度，将所得混合液同细胞分离液加入离心管内；(5)：将步骤(4)的混合液与细胞分离液离心，得到环状乳白色层；(6)：将步骤(5)所得环状乳白色层吸取后与细胞洗涤液混合，离心，将沉淀洗涤。

技术领域

本发明涉及干生物医学技术领域，尤其涉及一种人外周血干细胞提取方法及应用。

背景技术

近30年里，造血干细胞被广泛地应用于血液病治疗的临床实践，已成为治疗和治愈恶性血液病、重型再生障碍性贫血、某些实体瘤、某些异常免疫病、某些遗传病、代谢病和极重度骨髓型放射病的最有效方法，已成为现代医学异军突起的重要方向。

生理状况下造血干细胞是定位在人体内平均氧浓度为3％的低氧环境中，而造血干细胞采集及处理程序则是在比人体内氧浓度高得多的21％氧气浓度环境下完成，目前全世界进行的普通细胞培养条件，都是远远超过生理条件的高氧气浓度。只是许多细胞对这种有毒的高氧环境的耐受能力比较高，干细胞这种相对脆弱的细胞则不同。研究人员发现，即便是短暂暴露于高氧环境下，也会给造血干细胞带来明显负面影响，造成造血干细胞数量减少、功能降低最终导致移植疗效下降。他们将这种效应称作为超出生理范围的氧休克/应激动 (extraphysiologicoxygen shock/stress，EPHOSS)。因此，需要提供一种避免给干细胞带来损害的干细胞提取方法。

发明内容

为解决背景技术中提到的问题，本发明的目的在于提供一种人外周血干细胞提取方法及应用。

为了实现上述目标，本发明的技术方案为：

一种人外周血干细胞提取方法，包括如下步骤：

(1)：取新鲜抗凝血与羟乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入环孢菌素 A，环保菌素A的浓度为0.3μg/ml，37℃条件下反应5-10分钟，得到混合液；

(2)：向步骤(1)所得的混合液中加入全血及组织稀释液，混匀，20℃～30 ℃条件下自然沉降20～30分钟，吸取上清液备用，其中全血及组织稀释液的体积为步骤(1)中所得的混合液的体积的二分之一；

(3)：向步骤(2)所得的上清液中加入细胞洗涤液，混匀，离心15分钟，弃上清液保留沉淀细胞，其中细胞洗涤液的体积为步骤(2)中所得上清液的两倍；

(4)：向步骤(3)所得的细胞沉淀中加入全血及组织稀释液形成混合液，调整细胞浓度为2×10⁸～1×10⁹个/ml，将所得混合液同细胞分离液加入离心管内，其中混合液叠加于细胞分离液的液面之上，混合液的体积为分离液的两倍；

(5)：将步骤(4)的混合液与细胞分离液离心20分钟，离心管中由上至下分为四层：

第一层：稀释液层；

第二层：环状乳白色层；

第三层：透明分离液层；

第四层：极少数红细胞层；

(6)：将步骤(5)所得环状乳白色层吸取后与细胞洗涤液混合，离心15 分钟，将沉淀洗涤即可得所需干细胞，其中，细胞洗涤液的体积为步骤(5)所得环状乳白色层的5～10倍。

一种人外周血干细胞提取方法在人体干细胞提取中的应用，包括如下步骤：