[发明专利]一种玉米miRNA及其在调控玉米植株抵抗玉米小斑病中的应用

权利要求书

1.一种玉米miRNA，其特征在于，该玉米miRNA用于响应玉米小斑病菌的侵染，所述玉米miRNA成熟转录本的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的玉米miRNA，其特征在于，所述玉米miRNA的初级转录本的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1-2任一所述的玉米miRNA在调控玉米植株抵抗玉米小斑病中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过在玉米中过表达和敲除所述玉米miRNA调控植株对玉米小斑病菌的抵抗能力。

5.一种玉米miRNA初级转录本的获得方法，其特征在于，以玉米miRNA初级转录本基因序列为模板设计特异性扩增引物，以玉米B73的cDNA为模板，通过PCR扩增技术获得玉米miRNA初级转录本。

6.根据权利要求5所述的获得方法，其特征在于，所述特异性扩增引物的序列为：

引物-F:GCTCTGGGCAGAGGACTGG；

引物-R:ACTGAAGAGGAGATGAGCCTAGC。

7.一种过量表达载体，其特征在于，利用同源重组方法将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米miRNA初级转录本连接至载体的酶切位点之间得到连接产物，反应后将所述连接产物转化到大肠杆菌中，利用质粒提取试剂盒，得到能表达所述玉米miRNA成熟转录本的载体质粒，即为过量表达载体。

8.一种敲除载体，其特征在于，所述敲除突变体载体为利用CRISPR/cas9敲除技术在核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米miRNA初级转录本中敲除sgRNA靶位点后克隆到CPB载体上获得。

9.根据权利要求8所述的敲除载体，其特征在于，所述sgRNA序列包括以下序列：

(1)sgRNA-1-FP GCTCTTGGATCCGCGTTCCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；sgRNA-1-RP CGACGGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGT；

(2)sgRNA-2-FP GCCAAGCGCGCTCTGGACGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；sgRNA-2-RPACGACGGCCAGTGCCAAGCTAAAAAAAGCACCGACTCGGT。

10.一种调控玉米植株抵抗玉米小斑病的方法，其特征在于，通过在玉米中过表达和敲除所述玉米miRNA调控植株对玉米小斑病菌的抵抗能力，具体为：

当在玉米中过表达所述玉米miRNA，玉米植株对玉米小斑病菌的抵抗能力弱，当在玉米中敲除所述玉米miRNA，玉米植株对玉米小斑病菌的抵抗能力强。