[发明专利]一种全局性调控蛋白基因AORI_1832的应用

说明书

本发明公开了一种全局性调控蛋白基因AORI_1832用于提高水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007的万古霉素发酵水平的应用，所述应用是在水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007中过表达AORI_1832基因。本发明还提供了一种提高万古霉素发酵水平的方法，包括在水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007中过表达AORI_1832基因。本发明通过生物信息学分析及基因过表达和敲除实验，确认基因AORI_1832编码的蛋白为AraC家族的全局性调控因子，该蛋白调控菌株的形态分化以及次级代谢产物万古霉素的产量。通过在万古霉素生产菌中过表达全局性调控基因，得到的菌株相比出发菌株，发酵产量提高了40％。本发明对利用基因工程手段改造原始菌株提高万古霉素的产量具有指导意义和利用价值。

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地说，是关于一种全局性调控蛋白基因AORI_1832的应用。

背景技术

万古霉素是一种糖肽类抗生素，对革兰氏阳性菌有很强的抑制活性，临床上是MRSA严重感染的首选药物。它作用于构建细胞壁所需的肽聚糖前体，与D-丙氨酸-D-丙氨酸结合，隔离细菌细胞壁交联反应的底物，同时影响转糖基化酶催化的脂质中间体II参入多糖细胞壁骨架。因为细菌较难通过单一基因突变而产生耐药性，从而使万古霉素保持相对长久的有效性。

万古霉素是水解角蛋白拟无枝酸菌(Amycolatopsis keratiniphila)的次级代谢产物。A.orientalis HCCB10007菌株通过菌种选育和发酵工艺优化已成为万古霉素的生产菌株。1989年，Skatrud等人首先提出了利用重组DNA技术改造抗生素的生产菌株，从那时起，重组DNA技术被广泛用于构建高产菌株。

构建高产菌株的思路主要有过表达整个生物合成基因簇、调整关键调控因子的表达量和过表达结构基因等，其中调整关键调控因子表达量的方式最为简单高效。2014年A.orientalis HCCB10007全基因组测序与比较基因组学的研究工作，为通过了解菌株调控机制、构建高效工程菌株以提高万古霉素产量提供了基础。

发明内容

本申请的发明人以水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007为出发菌株，分别构建了AORI_1832基因过表达菌株以及AORI_1832基因缺失菌株，并进一步研究了出发菌株、AORI_1832基因敲除菌株和过表达菌株三株菌株的生长情况及菌丝情况，测定了三株菌株发酵后的生物量及万古霉素产量，以及出发菌株和AORI_1832基因过表达菌株的基因相对表达量，结果显示，AORI_1832基因是一类全局性转录调控因子，属于AraC家族的调控蛋白。

因此，本发明的第一个方面，提供了一种AORI_1832基因的应用，用于提高水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007的万古霉素发酵水平。

根据本发明，所述应用是在水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007中过表达AORI_1832基因。

根据本发明，所述在水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007中过表达AORI_1832基因包括以下步骤：

步骤1：构建用于过表达全局性调控蛋白基因AORI_1832的过表达质粒；

步骤2：将步骤1得到的过表达质粒电转化入水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007中，筛选得到AORI_1832基因过表达的重组菌株。

根据本发明的优选实施例，所述AORI_1832基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面，提供了一种提高万古霉素发酵水平的方法，包括在水解角蛋白拟无枝酸菌(A.keratiniphila)HCCB10007中过表达AORI_1832基因。