[发明专利]一种转录调控因子LysG突变体及其应用

说明书

本发明以一种新型的转录调控因子LysG突变体及受其调控的启动子为研究对象，特别涉及所述突变体在代谢工程中调控基因表达和高通量筛选方面的优势及应用，属于代谢工程领域。本发明通过对LysG进行点突变获得lysG^E15D_,^A54D_,^I164V突变体，在组氨酸的调控下，突变体对下游基因的表达强度相对于野生型提高了7.5倍，即利用组氨酸的浓度可对下游基因进行更高强度的调控，因此可更好用于代谢工程调控以及应用于生产组氨酸菌株的高通量筛选。

技术领域：

本发明以一种新型的转录调控因子LysG突变体及受其调控的启动子为研究对象，特别涉及所述突变体在代谢工程中调控基因表达和高通量筛选方面的优势及应用，属于代谢工程领域。

背景技术：

生物体内广泛存在转录调控因子，其中一类转录调控因子能够受细胞内特定小分子代谢物的诱导，在不同小分子代谢物浓度下，通过改变自身结构，结合在目标基因启动子部分的特定DNA片段上，来调控目标基因元件转录水平。如果目标基因元件又能够影响生物体特定的性状(例如荧光强度、细胞生长状况以及特定代谢通路的开关等)，那么就可以利用小分子代谢物的浓度来调控生物体特定的性状。如果目标基因是代谢途径中的相关酶或者相关基因，就可以通过转录调控因子表达强弱，来控制代谢途径的强弱，应用于代谢工程改造等方面；如果目标基因是荧光蛋白、抗性基因等，那么就可以将小分子代谢物的浓度与荧光的强度，细胞在抗生素存在下的生长水平相偶联，从而构建出一种可以响应小分子代谢物浓度的生物传感器，筛选小分子代谢物的高产菌株，应用于菌株的高通量筛选等方面。

研究表明，转录调控因子LysG和ArgP都是小分子诱导蛋白，属于LysR型转录调控蛋白家族的同源成员，它们分别来自谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌，其中LysG能够在赖氨酸、精氨酸或组氨酸的诱导下调控LysE的转录。ArgP只能够受精氨酸的诱导，调控下游基因元件ArgO的转录。研究表明，在大肠杆菌中引入LysG及其lysE上游的调控序列后，ArgP和LysG的调控作用互不影响，不能相互调控LysE和ArgO的表达。因此，将谷氨酸棒杆菌来源的LysG及其调控的核酸序列引入到大肠杆菌后，有可能构建出受赖氨酸、精氨酸或组氨酸诱导表达的基因，用于相关大肠杆菌的代谢调控或高通量筛选。

有人在谷氨酸棒杆菌中，以转录调控因子lysG响应赖氨酸、精氨酸和组氨酸的诱导调控目标基因LysE的转录为基础，设计开发了包含LysG、LysE启动子P_lysE，以及黄色荧光蛋白的一种适用于细胞内赖氨酸检测的生物传感器，该生物传感器是利用荧光的强弱来偶联赖氨酸的浓度。因此用该生物传感器结合流式细胞仪，对基因组突变文库进行高通量筛选，分离出产量提高的突变体，从而证明了基于转录调控因子LysG的赖氨酸生物传感器在高通量筛选方面的可行性(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)。lysG受到赖氨酸、精氨酸或组氨酸的调控后，能够诱导P_lysE转录的起始，提高P_lysE下游基因的表达，在一定赖氨酸、精氨酸或组氨酸诱导物浓度下，其诱导P_lysE下游基因表达的水平越高，代表体系内赖氨酸、精氨酸或组氨酸的浓度越高。因此，筛选出能够受到赖氨酸、精氨酸或组氨酸的高效调控的lysG，对于相关代谢工程调控和高通量筛选具有重要意义。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明通过对转录调控因子lysG进行突变，筛选出了一种对组氨酸响应程度更高的lysG突变体，以便于在组氨酸生产菌株高通量筛选方面发挥更加积极的作用。