[发明专利]间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及间充质干细胞的制备方法。本发明提供了间充质干细胞的制备方法，取口腔黏膜组织培养，清洗后，经组织块贴壁培养，获得所述间充质干细胞。本发明采用的制备方法明确了舌黏膜、颊黏膜、牙龈、上腭黏膜在内的口腔黏膜组织中均可提取到间充质干细胞，同时通过分离获得口腔黏膜下层，减少上皮层中上皮细胞干扰，更易通过后续的组织贴壁法培养获得间充质干细胞。而且，本发明采用的制备方法无需使用酶进行消化，仅采用简单易操作的组织块贴壁法，简化了操作步骤。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及间充质干细胞的制备方法。

背景技术

2016年国家提出发展先进高效生物技术，开展重大疫苗、抗体研制、免疫治疗、基因治疗、细胞治疗、干细胞与再生医学、人体微生物组解析及调控等关键技术研究的指导方向。

间充质干细胞是一种重要的干细胞，具有多向分化能力，可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等细胞，是细胞治疗的重要种子细胞之一。2006 年，国际细胞治疗协会(International Society forCellGene Therapy,ISCT) 规范了间充质干细胞的定义，至少需符合以下三个标准：1.呈梭形、贴壁生长； 2.细胞表面表达特定的特异性抗原(标记物)：CD105、CD73和CD90(阳性表达)；CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR(阴性表达)；3.具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的能力。

临床研究和使用的种类包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胰岛β细胞、成纤维细胞等。现有研究已从牙髓、牙周、根尖周等组织中提取出间充质干细胞，但上述来源的间充质干细胞，存在来源有限、提取受限、难以大量培养扩增的难点。

现有研究多采用酶消化法培养口腔黏膜间充质干细胞，提高了技术难度，增加了操作步骤和技术成本。酶消化过程，可能影响间充质干细胞的活性。

因此，寻找一种技术难度低、操作步骤简单的培养口腔黏膜间充质干细胞的方法至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了间充质干细胞的制备方法。本发明采用的制备方法明确了舌黏膜、颊黏膜、牙龈、上腭黏膜在内的口腔黏膜组织中均可提取到间充质干细胞，同时通过分离获得口腔黏膜下层，减少上皮层中上皮细胞干扰，更易通过后续的组织贴壁法培养获得间充质干细胞。而且，本发明采用的制备方法无需使用酶进行消化，仅采用简单易操作的组织块贴壁法，简化了操作步骤。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了间充质干细胞的制备方法，取口腔黏膜组织培养，清洗后，经组织块贴壁培养，获得所述间充质干细胞。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织为口腔下层黏膜组织。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织培养不包括酶消化的步骤。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织包括：舌黏膜、颊黏膜、牙龈或上腭黏膜中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述口腔黏膜组织培养离体后采用α-MEM培养基保存；所述α-MEM培养基包括2％的青霉素和链霉素。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述清洗采用PBS缓冲液；所述PBS缓冲液包括2％的青霉素和链霉素。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述组织块贴壁培养包括：取组织块制成混悬液，第一培养，翻转后，第二培养。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述制成混悬液或所述第一培养采用α-MEM培养基；所述α-MEM培养基包括1％的抗生素和10％的 FBS。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述抗生素包括青霉素和链霉素。