[发明专利]一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种D‑对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用，本发明通过将D‑海因酶和D‑氨甲酰水解酶的突变体连接在双表达质粒pETduet‑1上，提高了D‑氨甲酰水解酶的表达，该菌株转化12h生产30g/L D‑对羟基苯甘氨酸的产量达到24.9g/L，摩尔转化率达到95.4％，转化12h生产40g/L D‑对羟基苯甘氨酸的产量达到30.4g/L，摩尔转化率达到87.4％；转化12h生产50g/L D‑对羟基苯甘氨酸的产量达到29.8g/L，转化24h产量达到33.0g/L，摩尔转化率75.9％。本发明方法在工业上用于提高D‑对羟基苯甘氨酸的产量具有极大的潜力和广泛的价值。

技术领域

本发明涉及一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的药物和食品添加剂，在半合成抗生素，多肽，激素，拟除虫菊脂，杀虫剂，甜味剂等的工业生产方面有广泛的应用，主要用于半合成羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄和头孢哌酮等抗生素，D-对羟基苯甘氨酸是目前需求量最大的D-型氨基酸，其产量每年在世界范围内达上千吨。

D-对羟基苯甘氨酸的制备方法主要分为化学合成法和海因酶转化法，目前，化学合成法是D-对羟基苯甘氨酸的主要生产方法，主要包括:不对称转化法，诱导结晶法以及化学拆分法。虽然目前合成D-对羟基苯甘氨酸的化学法较多，但是这些方法在不同程度上都存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低以及生产成本高的问题。因此，越来越多的研究人员寻求利用酶转化法来合成D-对羟基苯甘氨酸。目前的酶转化法主要是海因酶法:以D,L对羟基苯海因(D,LHPH)为底物，在D-海因酶(D-hydantoinase,DHase)和D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)催化下，经中间物N-氨甲酰基D-对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，生成光学纯的D-HPG的反应,被称为生产D-HPG的海因酶法。

然而，在海因酶法生产过程中，D-氨甲酰水解酶由于表达量和稳定性等问题制约着其工业化生产。因此，也有用生物转化法来生产D-对羟基苯甘氨酸的，目前生物转化法主要包括大肠杆菌转化和枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌并不能解决N-氨甲酰水解酶的表达量低、稳定性以及其可溶性表达的问题，且因其为革兰氏阳性菌，厚的细胞壁也成为其在催化过程中的限制性因素之一，而现有用于D-对羟基苯甘氨酸生产的大肠杆菌在表达N-氨甲酰水解酶时表达量低，导致D-对羟基苯甘氨酸的产量无法进一步提升。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种表达了D-海因酶(GsDH)和D-氨甲酰水解酶突变体(AkDC_A273T)的重组大肠杆菌，能够实现提高D-对羟基苯甘氨酸产量的目的。

本发明的第一个目的是提供一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株，所述的菌株是以质粒pETduet-1为载体，在大肠杆菌宿主中表达D-海因酶(GsDH)和D-氨甲酰水解酶突变体(AkDC_A273T)。

进一步地，所述的D-氨甲酰水解酶突变体和D-海因酶均以T7启动子启动表达，其中，D-氨甲酰水解酶突变体构建在第一个启动子之后，D-海因酶构建在第二个启动子之后。

进一步地，以质粒pETduet-1为载体构建的重组质粒的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的D-海因酶(GsDH)来源于Geobacillus stearothermophilus，本发明的D-氨甲酰水解酶(AkDC)来源于Agrobacterium sp.(strain KNK712)。

进一步地，所述的D-海因酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的D-氨甲酰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。