[发明专利]一种利用TR-FRET检测DNA聚合酶活性抑制率的方法及应用

权利要求书

1.一种利用TR-FRET 检测DNA 聚合酶活性抑制率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1，将系列浓度的DNA 聚合酶抑制剂的溶液分别添加在不同的反应容器内；向所述反应容器内分别加入DNA 聚合酶溶液，混合后进行第一次孵育；

S2，向所述反应容器内分别加入含有底物模板和dNTP的溶液后进行混合；然后向所述反应容器内分别加入包含标记有镧系元素的特异性配对成员中的一员的溶液，混合后进行第二次孵育；其中所述dNTP中的其中一种核苷酸标记有荧光基团，所述底物模板上标记有特异性配对成员中的另一员；

S3，采用激光照射所述反应容器，记录不同的反应容器在所述荧光基团的吸收波长和发射波长下的荧光信号值，并计算在不同浓度的DNA 聚合酶抑制剂存在下，所述荧光基团发射波长下的荧光信号值与吸收波长下的荧光信号值的比值；

S4，在相同条件下获得在不存在DNA 聚合酶抑制剂的条件下，所述荧光基团发射波长下的荧光信号值与吸收波长下的荧光信号值的比值2；

S5，计算不同浓度的DNA 聚合酶抑制剂对所述DNA 聚合酶的活性抑制率；其中所述活性抑制率的计算公式为：（比值2-比值1）/比值2×100%；

S6，绘制DNA 聚合酶抑制剂的浓度与DNA 聚合酶的活性抑制率的曲线。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述系列浓度的DNA 聚合酶抑制剂的溶液的浓度范围为0.01nM~10 μM；和/或

步骤S1中，所述DNA 聚合酶溶液的浓度4~5 nM。

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述含有底物模板和dNTP的溶液中底物模板的浓度为9~10 nM；标记有荧光基团的相应种类核苷酸的浓度为90~100nM，未标记荧光基团的其余三种核苷酸的浓度均为25~30 μM；

优选地，所述荧光基团选自FITC、5-FAM和Cy5中的任意一种。

4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述底物模板由能够在退火条件下形成双链DNA的两条单链DNA序列组成，其中一条为模板序列，另一条为引物序列，所述模板序列的长度为25~30个碱基，所述引物序列的长度为10~16个碱基，且所述引物序列的5’端标记有特异性配对成员中的另一员；优选地，所述模板序列的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述引物序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述包含标记有镧系元素的特异性配对成员中的一员的溶液中标记有镧系元素的特异性配对成员中的一员的浓度为2~3nM；优选地，所述镧系元素选自铽、铕、钐和镝中的任意一种；所述特异性配对成员选自生物素-链酶亲和素和抗原-结合所述抗原的抗体中的任意一种。

6. 根据权利要5所述的方法，其特征在于，所述DNA 聚合酶溶液、含有底物模板和dNTP的溶液和包含标记有镧系元素的特异性配对成员中的一员的溶液的体积比为（1~1.2）:（1~1.2）:（1~1.2），优选为1:1:1；进一步优选地，所述DNA 聚合酶溶液、含有底物模板和dNTP的溶液和包含标记有镧系元素的特异性配对成员中的一员的溶液的体积均为4~5μL，所述DNA聚合酶抑制剂的溶液的体积为0.12~0.15μL。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一次孵育的温度为20~25℃，时间为15~20min；所述第二次孵育的温度为20~25℃，时间为60~70min。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述曲线的拟合方程为：

Y=B + (T-B)/(1+10^((LogIC50-X) ×H))；

其中，Y为活性抑制率（%），X为抑制剂浓度的Log 值，T为曲线在Y轴上所对应的最高值，B为曲线在Y轴上所对应的最低值，IC50为抑制剂的半抑制浓度，H为曲线对应的坡度。