[发明专利]一种高催化活性及温度稳定性的壳聚糖酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种高催化活性及稳定性的壳聚糖酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。壳聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的壳聚糖酶第242位赖氨酸突变为脯氨酸(K242P)或谷氨酸(K242D)或苯丙氨酸(K242F)。本发明壳聚糖酶酶突变体与野生型壳聚糖酶相比，K242P比酶活提高了1.74倍，温度稳定性提高了1.67倍，K242D比酶活提高了1.87倍，K242D比酶活提高了1.84倍，其中K242P突变酶的比酶活与温度稳定性均得到了显著提升，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种高催化活性及高温度稳定性的壳聚糖酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

壳聚糖是一种天然的碱性多糖，由氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接形成，在自然界中的含量仅次于纤维素。有研究报道表明，壳聚糖对大部分真菌、细菌以及病毒均有抑制作用，因此，在医药、农业等方面有较大的应用价值。然而，在实际应用过程中，由于壳聚糖具有强分子间氢键作用，结构排列紧密，易结晶等特点，因此，导致其溶解性很差，不溶于水，只溶于有机酸，这在很大程度上限制了壳聚糖的应用。

壳寡糖是壳聚糖被降解后的产物，聚合度在2-10之间，与壳聚糖相比，壳寡糖具有更强的抗菌性能。此外，在低聚合度下，壳寡糖也表现出了壳聚糖不具有的生物活性和功能，如水溶性强、吸湿性、降血脂、调节肠道微生态平衡等，因此，其应用前景更为广阔。

目前，壳寡糖的生产方法主要有物理降解法、化学降解法和生物酶解法。物理降解法利用辐射、超声波等手段裂解糖苷键，具有无化学污染的优点，但是这种方法生产的壳寡糖聚合度高，没有理想的生物学活性；化学降解法利用酸、氧化剂等化学试剂裂解糖苷键，虽然可以产生低聚合度的壳寡糖，但是具有反应产物可控性低、污染环境等缺点；生物酶法是利用专一性或非专一性酶水解壳聚糖生产壳寡糖，具有反应条件温和，无环境污染以及产物聚合度可控等其他方法没有的优点。目前有多种酶被报道具有水解壳聚糖的活性，如壳聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶等。在这些酶当中，壳聚糖酶(EC.3.2.1.132)是专一性水解壳聚糖为壳寡糖的糖苷水解酶，以内切或外切的形式切断壳聚糖的β-1，4-糖苷键，将壳聚糖水解为聚合度为2-10的壳寡糖。工业生产使用壳聚糖酶需要有高催化活性和好的稳定性，而目前为止，已报道的壳聚糖酶酶学性质尚需提升，因此如何提高壳聚糖酶催化活性的研究成为近期的研究热点。目前获得具有优良催化性能的酶的方法主要有菌株筛选及定点突变。其中菌株筛选具有工作量大，不一定能获得优良酶，而定点突变工作量适中，突变位点选择合适就会快速获得优良酶。其中将生物信息学分析与定点突变相结合对酶进行理性设计，是一种可以快速获得活性提高的突变酶的方法。

发明内容

针对现有壳聚糖酶的不足，本发明目的在于提供一种高催化活性及高温度稳定性的壳聚糖酶突变体及其应用，基于酶活性及稳定性的显著提升，该突变体能广泛应用到壳寡糖生产中。

本发明的高催化活性及高温度稳定性的壳聚糖酶突变体，为编码枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的氨基酸序列上第242位赖氨酸进行定点突变，且定点突变为脯氨酸(K242P)或谷氨酸(K242D)或苯丙氨酸(K242F)；壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

具体的，本发明涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶是实验室前期通过理性设计获得了催化活性提高的突变酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，基因序列为SEQ ID NO：2。为进一步提高壳聚糖酶的催化活性，通过蛋白序列对比分析的方法，筛选出可能对BsCsn46A催化性能有影响的位点，选取其中1个位点进行饱和突变，并将不同的突变体分别在大肠杆菌(DE3)中进行了活性表达，并对突变酶的酶学性质进行了研究。

SEQ ID NO：1