[发明专利]高保真性限制性内切核酸酶

说明书

本发明的发明名称为高保真性限制性内切核酸酶。提供用于工程化改造具有降低的星号活性的突变酶的方法和组合物，其中，所述突变酶在特定缓冲液中的保真性指数(FI)大于非突变酶在相同缓冲液中的FI。

本申请是申请日为2011年2月7日、申请号为2011800170168(PCT/US2011/023944)、发明名称为“高保真性限制性内切核酸酶”的专利申请的分案申请(其申请日为2011年2月7日、申请号为2018111218785、发明名称为“高保真性限制性内切核酸酶”)的分案申请。

发明背景

限制性内切核酸酶是以序列特异性方式切割双链DNA的酶(Roberts,R.J.ProcNatl Acad Sci USA 102:5905-5908(2005)；Roberts,et al.Nucleic Acids Res 31:1805-1812(2003)；Roberts,et al.Nucleic Acids Res 33:D230-232(2005)；Alves,etal.restriction endonucleases(限制性内切核酸酶),“Protein Engineering ofRestriction Enzymes(限制酶的蛋白质工程),”ed.Pingoud,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,New York,393-407(2004))。它们广泛存在于原核生物体中(Raleigh,et al.,BacterialGenomesPhysical Structure andAnalysis(细菌基因组物理结构和分析),Ch.8,eds.De Bruijin,et al.,ChapmanHall,New York,78-92(1998))，其中它们形成限制-修饰系统的部分，该限制-修饰系统主要由内切核酸酶和甲基转移酶组成。相关的甲基转移酶甲基化其配对内切核酸酶识别的相同特定序列，并使修饰的DNA抵抗内切核酸酶的切割，以便适当保护宿主DNA。然而，当有外源DNA，尤其是噬菌体DNA侵入时，外源DNA将在其被完全甲基化之前降解。限制性修饰系统的主要生物学功能是保护宿主免于噬菌体感染(Arber Science 205:361-365(1979))。也提出了其它功能，如涉及重组和转座(Carlson,et al.Mol Microbiol,27:671-676(1998)；Heitman,Genet Eng(N Y)15:57-108(1993)；McKane,et al.Genetics 139:35-43(1995))。

大约3,000种已知限制性内切核酸酶对其250种以上的不同靶序列的特异性可以被认为是它们最令人感兴趣的特征。在发现了第一种限制性内切核酸酶的序列特异性性质(Danna,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 68:2913-2917(1971)；Kelly,et al.,J MolBiol 51:393-409(1970))之后，不久科学家们就发现，某些限制性内切核酸酶在非最佳条件下切割与其限定的识别序列相似但不一致的序列(Polisky,et al.,Proc Natl AcadSci U S A,72:3310-3314(1975)；Nasri,et al.,Nucleic Acids Res 14:811-821(1986))。这种松弛的特异性(relaxed specificity)被称为限制性内切核酸酶的星号活性(star activity)。