[发明专利]用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用

权利要求书

1.用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列，其特征在于根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的引物序列是：

上游引物VP_AHPND-RPA-FA: CGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTG；

下游引物VP_AHPND-RPA-RA: CTGATGATAGAATGCATTATCAGGGCGTTG；

用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的探针序列是：

VP_AHPND-RPA-PA: CTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATG/FAM-dT//THF/G/ BHQ1-dT/ACAACGTGATGAAAC/C3spacer/；

用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的引物序列是：

上游引物VP_AHPND-RPA-FB: TACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAAC；

下游引物VP_AHPND-RPA-RB: CGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTAC；

用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的探针序列是：

VP_AHPND-RPA-PB: CAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGC/FAM-dT//THF/G

/BHQ1-dT/GGTCTGGATTATAAG/C3spacer/；

用于检测虾肝肠胞虫的引物序列是：

上游引物EHP-RPA-F: AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAAC；

下游引物EHP-RPA-R: CTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGC；

用于检测虾肝肠胞虫的探针序列是：

EHP-RPA-P: TAGAACTACAGCGGTGTCTAATCACTTTCGA/FAM-dT//THF/C/BQH-dT/

CTAGCCTTCGTCCTTG/C3spacer/。

2.根据权利要求1所述的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列的应用，其特征在于具体检测步骤如下：

（1）微流控芯片的点制：首先将根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列设计的三对引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理，每个反应池内的引物包含检测靶标DNA序列对应的上游引物和下游引物终浓度各2 pmol；

（2）配置反应体系：反应体系各成分分别为：12 μL RPA反应缓冲液，1 μL 280 mM醋酸镁溶液，1 μL的10 µM探针溶液，加双蒸水补足反应体系，1个单元所需的总体系为20 µL；

（3）微流控芯片上的RPA反应：将步骤（2）的反应体系与1 µL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进芯片，将芯片放置在等温扩增微流控芯片核酸分析仪上，进行RPA反应，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，反应结束后由该仪器自行完成结果判定，其中阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示。

3.根据权利要求2所述的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列的应用，其特征在于步骤（3）所述的RPA反应进行核酸扩增的温度为39 ℃，反应时间为20 min。