[发明专利]一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法

权利要求书

1.一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

(1)脂肪干细胞的准备：抽取人体脂肪，均匀分装到离心管中，向每支离心管中加生理盐水吹吸混匀，离心，取上层，加入EDTA-胰蛋白酶和I型胶原酶，混匀后放入37℃恒温摇床中消化0.8～1h，之后加入无血清培养基终止消化，吹吸混匀，离心，弃去脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层，加入生理盐水混匀，离心，弃上清，得到的细胞转移至培养皿中进行培养即可得到脂肪干细胞；

(2)脂肪干细胞的预处理：将脂肪干细胞用含青霉素、链霉素的PBS反复清洗，剪碎至糊状，移入培养瓶，加入I型胶原酶，吹吸混匀后继续放入37℃恒温摇床中消化2～3h，离心，弃上清，加入DMEM-F12培养液中吹打细胞沉淀，细胞筛过滤，于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度条件下培养，每间隔24h换一次培养液，生长至70％～80％融合时，用胰蛋白酶与EDTA消化传代，将获得的脂肪间充质干细胞体外持续传代培养；

(3)将脂肪来源的脂肪间充质干细胞采用特定培养基诱导培养，即可生成诱导性多能干细胞；

(4)培养、传代所述诱导性多能干细胞以及提供诱导性多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1中抽取的脂肪为人体腹部、臀部或大腿脂肪。

3.根据权利要求1所述的一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中人体脂肪的分装体积不大于离心管体积的1/2。

4.根据权利要求1所述的一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法，其特征在于，所述特定培养基以DMEM-F12培养基和MesemCult-XF培养基组成的组合培养基为基础培养基，还包括：10～25mg/ml巴豆提取物、15～40mg/ml的腔昆布乙醇溶液提取物、8～20μM的LY-364947和10～22μg/ml的RPMI1640。

5.根据权利要求4所述的一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法，其特征在于，所述巴豆提取物通过将巴豆种子采用体积分数为50～80％乙醚溶液提取获得。

6.根据权利要求5所述的一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人IPS细胞的方法，其特征在于，所述特定培养基中还可以添加营养混合物，所述营养混合物包括氨基酸、维生素和无机盐。