[发明专利]一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法

权利要求书

1.一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取样

采集河道窄处的0～15cm处表层底泥；

2)预处理

将样品悬浮在0.85～0.9％生理盐水中，超声处理，然后离心混合培养物，将所得颗粒重新悬浮在0.85～0.9％生理盐水中，得到再悬浮溶液；

3)富集培养

将步骤2)得到的再悬浮溶液经过多次浓缩循环后，将得到的培养物涂布在LB琼脂平板上，在30℃下培养；最后选择单个菌落，并在LB琼脂平板上重复划线，以获得纯菌落；

4)猝灭菌株初筛

将紫杆菌CV026倒在已制备的LB琼脂平板表面，且在LB琼脂平板上制备6mm的微孔，将细菌菌株和5μmol/LAHL倒入微孔中；对照组中只含有外源AHL，30℃培养；最终结果显示不变为紫色的作为猝灭菌株；

5)无细胞裂解液制备

将步骤4)得到的猝灭菌株在最小培养基中在30℃培养，然后离心后收集细胞颗粒，并将其重新悬浮在磷酸钾缓冲液，其研磨以获得无细胞裂解液并离心，上清液过滤后，滤液作为无细胞裂解物收集，在-20℃储存；

6)猝灭菌株复筛

进行无细胞裂解物分析以量化降解的信号分子，酰化高丝氨酸内酯化合物，制备QQ菌株分离物的无细胞裂解液，为了降解AHL，将紫杆菌CV026在含有LB的培养基中培养18小时，将50μL紫杆菌CV026培养物接种在补充了2μL0.5mg/mL AHL和100μLQQ菌株分离物的无细胞裂解液的LB培养基中，并在30℃120rpm下保持24小时，然后1:1培养物和二甲基亚砜以8000rpm离心5分钟，以溶解紫杆菌CV026并去除细胞，将上清液添加到无菌聚乙烯96孔微孔板的微孔中，将采集的细菌细胞重新悬浮在无菌蒸馏水中，并转移到微量滴定板的微孔中，培养基在30℃培养48小时，在550nm处分析紫杆菌CV026的吸光度，在600nm处分析细胞生长的吸光度，将结果与含有仅补充AHL的紫杆菌CV026的分析对照进行比较，得到猝灭菌株；

7)接种

将步骤7)得到的猝灭菌株的菌悬液接种至硫铁矿土壤中，其中猝灭菌株的菌悬液浓度为10⁸CFU/mL，投加到硫铁矿土壤中的猝灭菌株比例为10⁷～10⁸CFU/g。

2.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤1)中，采用采样器采集河道窄处的0～15cm处表层底泥。

3.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤2)中，超声处理30秒。

4.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤2)中，以4500rpm离心15min混合培养物。

5.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤3)中，具体实现方法如下：

第一次浓缩循环：将再悬浮溶液添加到最小培养基和AHL中，在30℃培养；

第二次浓缩循环：将第一个周期培养物转移到新鲜最小培养基中，培养；

第三次浓缩循环：将第二周期培养物转移到新鲜最小培养基中，培养；

将第三周期培养物涂布在LB琼脂平板上，在30℃下培养。

6.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤4)中，紫杆菌CV026通过在20μg/mL卡那霉素存在下培养过夜来制备得到。

7.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤4)中，最终结果显示变为紫色说明该菌株没有猝灭能力或者猝灭能力较弱。

8.根据权利要求1所述的一种通过猝灭菌株抑制硫铁矿酸性废水产生的方法，其特征在于，步骤5)中，以12000rpm离心10分钟。