[发明专利]一种分泌GLP-1的基因工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种分泌GLP‑1的基因工程菌及其制备方法和应用，所述基因工程菌CB‑pMTL007‑GLP‑1是将GLP‑1基因序列整合进丁酸梭菌NCU‑02(CGMCC No.25504)的基因组中而制备得到的，所述基因工程菌具有治疗二型糖尿病、降高血压以及改善帕金森的作用。本发明采用丁酸梭菌NCU‑02(CGMCC No.25504)作为表达GLP‑1的重组表达载体的宿主，使得该分泌GLP‑1的蛋白表达系统中的重组质粒具有良好的遗传稳定性，也具有与野生型丁酸梭菌NCU‑02(CGMCC No.25504)同样的耐酸、耐胆盐、抗氧化能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种分泌GLP-1的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)是1983年被发现的第二个肠促胰岛素，由胰高血糖素原基因编码合成。GLP-1作为肠道来源的激素，可以与全身多个组织受体结合发挥不同生理功能，然而内源性GLP-1的氨基酸序列中存在可被DPP-IV识别的位点而易被其降解，因此半衰期极短，严重限制了其生理效能。目前，大多数研究主要采取优化天然GLP-1序列和开发DPP-IV抑制剂两种策略来延长其半衰期。尽管GLP-1类似物及DPP-IV抑制剂的治疗效果较好，但其来源主要通过化学合成，成本高、售价昂贵，且需长期皮下注射给药，巨大的经济负担及治疗痛苦限制了GLP-1相关药物的大范围临床普及。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又称酪酸梭状芽孢杆菌，由于产生的酪酸又叫丁酸，所以也被称为丁酸梭菌，丁酸梭菌是人的正常肠道菌之一，严格厌氧，为革兰阳性菌。丁酸梭菌能耐受胃酸进入肠道，分泌肠粘膜再生和修复的重要营养物质酪酸(丁酸)并能促进双歧杆菌等肠道有益菌生长，抑制痢疾志贺氏菌等肠道有害菌生长，恢复肠道菌群平衡，减少胺、氨、吲哚等肠道毒素的产生及对肠粘膜的毒害，恢复肠免疫功能和正常的生理功能，纠正肠免疫紊乱，恢复肠免疫耐受力，消除炎症、溃疡，可以有效治疗高血压，降血糖以及改善帕金森。同时丁酸梭菌在肠道内产生酶和维生素类有益物质，促进营养物质的消化吸收。

随着技术发展，工程菌的可行性和应用性愈发得到权威肯定。基因改造的工程细菌用于疾病治疗日益受到重视，其可持续释放目的基因蛋白，能解决GLP-1等目的基因蛋白快速降解的应用难题。将丁酸梭菌与GLP-1联合使用或许是个可行途径，经基因工程改造，丁酸梭菌可作为给药载体，表达特定产物以实现诊断和治疗目的。

丁酸梭菌作为基因工程菌的难点：

1.梭菌中存在着非常严格的限制修饰系统，外源DNA进入梭菌后很快就会被降解。

2.与GLP-1联合使用造成胞外GLP-1表达量较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因工程菌能够解决上述技术问题，并提供一种制备该基因工程菌的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种分泌GLP-1的基因工程菌，所述基因工程菌CB-pMTL007-GLP-1是将GLP-1基因序列整合进丁酸梭菌NCU-02(CGMCC No.25504)的基因组中而制备得到的，所述基因工程菌具有治疗二型糖尿病、降高血压以及改善帕金森的作用，所述丁酸梭菌NCU-02的保藏号为CGMCC No.25504，保藏日期为2022年8月8日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：Clostridium butyricum。

本发明还提供一种分泌GLP-1的基因工程菌的制备方法，步骤如下：

(1)E.coli CA434感受态制备；

(2)将编码人源GLP-1的核酸片段插入空载体pMTL007获得重组质粒，重组质粒热激转化至E.coli CA434；