[发明专利]一种自主进化系统及其应用

说明书

本发明公开了一种自主进化系统，包括调控元件、突变模块和保真模块，保真模块包括错配修复蛋白基因mutH、mutL、mutS和解旋酶基因recG，突变模块包括易突变基因如DNA Pol IV基因dinB、编码应激因子基因rpoS、rpoD、编码损伤反应蛋白基因recA；还公开了一种耐高糖产缬氨酸大肠杆菌的构建方法。本发明聚焦易导致突变基因和错配修复基因，利用高糖适应性培养并结合代谢改造筛选优良表型，增加应激细胞的自发高存活率及正向突变的富集；选育葡萄糖耐受性好、氨基酸发酵能力增强、传代稳定性强的L‑缬氨酸生产菌株E.coli，可为高产氨基酸且耐受环境胁迫的E.coli菌株选育提供研究基础。

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，具体涉及一种自主进化系统及其应用。

背景技术

L-缬氨酸是优良的营养增补剂，主要依赖于微生物发酵生产。L-缬氨酸的生产菌株主要包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。高产L-缬氨酸菌株C.glutamicum代谢网络复杂，由于遗传信息的匮乏而导致菌株改造步履维艰。在以S.cerevisiae为宿主菌的体系中代谢改造L-缬氨酸，缺乏强有力的受严格调控的启动子，发酵周期较长，营养要求复杂，不适于高密度培养，发酵后期的营养盐及单糖组分增加了分离纯化成本。E.coli因其遗传背景清晰、发酵周期短、葡萄糖消耗率高、成熟的基因操作工具而成为优良的氨基酸生产模式菌株。葡萄糖是微生物发酵生产L-缬氨酸的主要糖质原料，发酵过程中葡萄糖供应不足导致菌体生长缓慢和产物产量较低，而葡萄糖浓度过高则会增加培养基渗透压力、阻碍葡萄糖和营养物质吸收、限制菌体生长及产物合成。野生型E.coli对葡萄糖耐受性差、代谢合成能力低，生物系统固有的复杂性对E.coli新表型提出挑战。

工业上主要通过微生物发酵法生产L-缬氨酸，获取耐受高糖胁迫且高产L-缬氨酸的目标表型成为制约L-缬氨酸规模化应用的瓶颈。存在问题主要包括：(1)多数野生型菌株不具备大量生产L-缬氨酸的能力，其产量主要由于菌株耐受性等因素的限制；(2)传统诱变育种是L-缬氨酸工业生产菌主要来源，但传统育种方式获得的菌株遗传背景不明确、遗传特性不稳定，L-缬氨酸生产菌株的诱变育种存活率低；(3)L-缬氨酸合成代谢网络复杂，繁琐地敲除或过表达L-缬氨酸合成路径依赖型基因，会对细胞造成损伤或增加其负荷，单一代谢工程改造导致产品产量提升有限。耐受性工程调控微生物细胞工厂胁迫抗性可通过巩固细胞屏障增强胁迫防御能力，加快应激反应提高损伤修复能力，但由于微生物系统代谢和调控网络的复杂性，难以获得鲁棒性较好的表型，因而耐受进化工程在筛选鲁棒性增强的微生物细胞工厂中愈发关键。耐受进化工程是指利用微生物基因组的可塑性，微生物种群在一定选择压力条件下不断进化，通过精密的调控机制与复杂的抵抗策略使微生物进化以生存和适应多种胁迫压力，获得有益突变的方法，可用于改善微生物细胞生长，提高化学品的浓度、得率和生产强度，发现未知的生物调控机制。

已有前人使用了合成生物学来构建大肠杆菌中的“群体感应”基因电路。LuxI、LuxR和酰基高丝氨酸内酯(AHL)在该回路中具有重要作用。LuxI酶催化AHL分子的合成，而LuxR则是AHL受体蛋白，可激活细菌群体感应转录效应。当细菌种群密度低，LuxR表达水平较低，合成的AHL分子不会在细胞积聚，而是迅速扩散到胞外。当细菌密度增加时，由于胞外AHL浓度梯度，导致AHL在细胞内积累。一旦胞内AHL浓度达到一定阈值，AHL分子与LuxR结合。反过来，LuxR激活PluxI启动子，从而启动靶基因的表达。因为AHL可以穿过细胞膜扩散，所以群体细菌中的AHL浓度基本相同，确保了细菌群体中基因表达程序的同步执行。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种自主进化系统，以遗传背景清晰的E.coli为研究模型，E.coli存活率的增加将导致新表型的进化，提高E.coli的存活率和进化效率可提升E.coli细胞工厂的耐受性和生产性能。

本发明第二目的是提供一种包括自主进化系统的基因工程菌或细胞。