[发明专利]POP基因或蛋白为靶点在筛选抑制小RNA病毒科病毒复制药物中的应用

说明书

本发明涉及一种POP基因或蛋白为靶点在筛选抑制小RNA病毒科病毒复制药物中的应用。具体为：①本发明发现抑制/沉默POP基因/蛋白能够抑制小RNA病毒的复制，可作为靶点用于筛选抑制小RNA病毒复制的药物；②以POP为靶点的小干扰RNA能够干扰小RNA病毒的复制；③靶向POP的sgRNA结合CRISPR‑Cas9技术实现了POP的完全敲除，获得的细胞系对小RNA病毒具有抗性表型，为研究POP在细胞内的分子机制提供研究工具和材料；④过表达POP可以显著促进小RNA病毒的表达和复制，即POP蛋白可作为病毒/病毒疫苗表达增效剂或生产增效剂的应用，构建的POP过表达细胞系可作为病毒/病毒疫苗生产细胞系。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种POP基因或蛋白为靶点在筛选抑制小RNA病毒科病毒复制药物中的应用。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、口疮病毒属(Aphthovirus)，基因组为单股正链RNA，约为8500nt，FMDV主要感染猪、牛和羊等偶蹄动物引起急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的动物烈性传染病，易感动物多达70余种；引发口腔粘膜、蹄部和乳房等处皮肤或无毛部位出现水疱和溃烂症状，导致生产力下降或丧失。该病可引起巨大的畜牧业经济损失和社会政治影响，被世界动物卫生组织(WOAH)列为法定报告的动物疫病，也是我国重点防范的I类动物疫病。至今仍在多个国家和地区流行，在2020年间，FMD的流行主要集中于欧亚大陆北部和西部、东南亚、南亚、非洲和南美洲的部分区域。FMDV包含7种血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1)、80多种亚型的毒株，不同血清型之间无有效的交叉保护，这使得FMD的防控更加困难。目前，免疫接种疫苗是抵御FMD最有效的措施。但其病原变异导致的宿主免疫及致病机理等方面的研究仍有待突破。因此，深入了解宿主蛋白调控FMDV复制的机制，通过CRISPR/Cas9技术构建抑制FMDV复制的细胞系对于致病机制及动物育种的研究意义重大。

CRISPR基因筛选工具的出现推动了高效、多功能和大规模筛选工作的新时代。CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可以有效地切割降解进入细菌和古细菌细胞中外源DNA。目前，CRISPR/Cas9系统已不仅仅是一种革命性的基因组编辑工具，还是一种重要的基因调控工具。基于CRISPR/Cas9系统的规模化筛选，为抗病毒研究提供了新思路。与传统的RNAi筛选相比，CRISPR筛选产生的脱靶效应更少，并且更通用，因为它们可以用于多种形式，例如敲除、敲低和激活筛选，并且可以靶向整个基因组的编码和非编码区域。因此，构建靶向病毒复制相关重要宿主基因敲除细胞系，将为FMDV的感染或复制机制及抗病毒育种研究提供重要的理论基础。

脯氨酰寡肽酶(prolyl Oligopeptidase，POP)也被称为脯氨酰内肽酶(PREP)或脯氨酸特异性内切蛋白酶，是一种高度保守的、丝氨酸蛋白酶S9家族成员，在不同物种的生物体内广泛分布。该家族的共同催化偏好是在脯氨酸残基的C末端切割小于3kDa的脯氨酰肽，能特异性水解多肽中脯氨酸残基或少数疏水性氨基酸残基的肽键。其酶学功能主要参与多种肽激素和神经肽的成熟和降解，如促甲状腺素释放激素(TRH)、血管紧张素(Ang)、α-黑素细胞刺激素(α-MSH)、精氨酸加压素(AVP)、促黄体激素释放激素(LHRH)、物质P(SP)和神经降压素(NT)等。POP的水解活性与底物的磷酸化状态有关，如果POP底物丝氨酸的P10残基发生了磷酸化，反应速率提高，反之POP甚至不能切割Ala-Ser之间的肽键。POP不仅通过酶学活性发挥生物学作用，还具有重要的非酶学活性。研究表明POP与帕金森病等神经疾病的发生密切相关，在许多癌症组织中高表达，且在恶性肿瘤中的表达高于良性肿瘤。