[发明专利]一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌、筛选方法及其应用

说明书

本发明涉及一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌、筛选方法及其应用。所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌已于2022年10月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 20221664。本发明中祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU‑3具有较为广泛的抗菌特性，该菌株对水稻弯孢叶斑病病菌、玉米茎基腐病病菌、棉花枯萎病病菌和小麦赤霉病病菌的抑菌效果较为明显，抑菌率菌均达到45％以上；其中对水稻弯孢叶斑病菌的抑菌率最高，抑菌率达到63.72％；同时其发酵产物同样对水稻弯孢叶斑病菌有非常明显的生防效果，抑菌率进一步得到显著提升高达75.61％。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌、筛选方法及其应用。

背景技术

祁术(Atractylodes macrocephala Koidz.)别名于术、冬祁术等，隶属于菊科(Compositae)菜蓟族(Cynareae)苍术属(Atractylodes DC.)，为多年生草本植物。祁术以根状茎入药，是一种常用重要的大宗中药材；最初记载于《神农本草经》中，其味甘、苦，性温，入脾、胃经，列为上品，集中分布于安徽、浙江、江西等地，其中以祁祁术的品质和药效最好。祁祁术(简称祁术)为安徽黄山特有种，是安徽省著名的道地药材。

现有研究表明，祁术主要含有挥发油、内酯类、多糖等药用成分，具有治疗糖尿病、抗衰老、抗肿瘤、抗炎症、抗菌等多种药用功能。因此，祁术具有很好的药用价值及开发前景。但祁术主要以野生资源为主，生长环境苛刻；同时，随着人类对于野生祁术的大量挖掘且长期缺乏保护，造成祁术野生种群处于极度濒危状态，亟需保护。因此，在保护祁术资源的同时开发其药用价值迫在眉睫。

植物内生菌定植于宿主体内，种类丰富，可产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，成为筛选具有抑菌活性次级代谢产物的重要资源。近年来，利用植物内生菌防治病害的研究也得到较多关注，如毕江涛等探究沙冬青植株中内生细菌的生防潜力，发现分离的内生细菌AMER007和AMER008对枸杞黑果病菌和小麦全蚀病菌有明显的拮抗作用(毕江涛,杨薇,李萍,贺达汉.濒危药用植物沙冬青内生细菌分离及其抑菌活性初步分析[J].天然产物研究与开发,2013,25(12):1621–1626.)；丁婷等对杜仲植物中的内生真菌进行分离纯化，共得到32株菌株，通过离体拮抗筛选试验发现22株内生真菌对玉米纹枯病菌有抑菌作用(丁婷,孙微微,王帅,江海洋.杜仲内生真菌中抗玉米纹枯病活性菌株的筛选[J].植物保护,2014,40(6):29–35.)。然而，目前对于祁术的研究主要集中于营养成分、生长繁殖、活性成分等，关于祁术内生菌方面的研究目前尚无报道。

针对上述情况，本发明从安徽祁门野生祁术中分离筛选出具有生防效果的菌株，利用形态学及分子生物学方法对其进行鉴定，并对其次级代谢产物进行抑菌活性研究。

发明内容

本发明从传统中药材祁术中分离得到内生菌株HSU–3，通过形态学及分子生物学方法，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并通过抑菌活性实验发现主要的抑菌物质存在于发酵产物中；该发酵产物中的抗菌物质对蛋白酶K和胰蛋白酶具有很强的稳定性，且有很好的热稳定性和紫外稳定性，在偏碱性环境中，具有很好的抑菌能力。

本发明的第一方面是：提供一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌，分离自采集于安徽省黄山市祁门县的祁术中；命名为祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌已于2022年10月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M20221664。

经过分离纯化后，该祁术内生贝莱斯芽孢杆菌菌株呈圆形单菌落，边缘不规则，表面较为粗糙不透明，菌落中心颜色较深呈浅黄色；利用扫描电镜进一步观察，该菌体呈杆状、圆端，菌体大小为1.5～2.0×0.8～1μm。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌对植物病原真菌具有拮抗作用。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌发酵产物对植物病原真菌具有拮抗作用。