[发明专利]检测低微生物量生物样本中细菌的引物组合、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测低微生物量生物样本中细菌的引物组合、试剂盒及方法，属于生物技术领域。所述引物组合由具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.10所示核苷酸序列序列的引物组成。本发明进一步公开了检测低微生物量生物样本中细菌的试剂盒和方法。利用本发明的引物组合、试剂盒和方法，能够有效提升低微生物量生物样本中细菌菌群检测的灵敏度和检出率，并且对降解样本具有更高的宽容度，可以有效提升降解样本中的菌群检测合格率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及检测低微生物量生物样本中细菌的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术

现有的研究已充分证明，人体微生物组对人类的健康维持和疾病发生紧密相关。针对16S rRNA基因序列的高可变区如V3、V4区进行高通量测序是目前常用且成熟的检测高丰度细菌群的手段，在肠道菌群、口腔菌群、阴道菌群、皮肤菌群等研究中已有广泛应用。然而将16S rRNA基因(V3V4)应用于肿瘤组织等样本内细菌群检测的效果却不理想。

肿瘤组织内细菌群检测遇到这些挑战：肿瘤组织内的细菌生物量较低，并且在从组织中提取到DNA中，属于细菌的DNA占比非常低。这些挑战会导致肿瘤组织内的细菌难以检出。现有的16S rRNA基因测序(V3-V4)检测低细菌生物量的样本灵敏度有限，不适合对肿瘤组织内细菌群做检测。

发明内容

为了解决上述技术问题的中一种，本发明旨在提供一种灵敏度高的肿瘤组织内细菌的检测引物和方法，采用多重特异性引物和多重PCR方法，并结合二代高通量量测序鉴定肿瘤组织内细菌的方法。为了达到该目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种检测低微生物量生物样本中细菌的引物组合，包括由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列序列的第一上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第一下游引物组成的第一引物对、由具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列序列的第二上游引物和具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的第二下游引物组成的第二引物对、由具有SEQID No.5所示核苷酸序列序列的第三上游引物和具有SEQ ID No.6所示核苷酸序列的第三下游引物组成的第三引物对、由具有SEQ ID No.7所示核苷酸序列序列的第四上游引物和具有SEQ ID No.8所示核苷酸序列的第四下游引物组成的第四引物对以及由具有SEQ IDNo.9所示核苷酸序列序列的第五上游引物和具有SEQ ID No.10所示核苷酸序列的第五下游引物组成的第五引物对。

在本发明的中，所述第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对分别靶向细菌16S rRNA基因的序列的V2、V3、V5、V6和V8区。

在本发明的一些实施方案中，各上游引物和下游引物还具有测序通用引物序列，以建立文库，利用高通量测序鉴定低微生物量生物样本中的细菌组成。

本发明第二方面提供一种检测低微生物量生物样本中细菌的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物组合。

进一步地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。在本发明的一些实施方案中，所述DNA提取试剂包括裂解试剂，所述裂解试剂包括但不限于CTAB、溶菌酶和蛋白酶。

更进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂和/或PCR纯化试剂。在本发明的一些实施方案中，所述PCR扩增试剂包括DNA聚合酶。在本发明的一些优选实施方案中，DNA聚合酶、Mg²⁺和dNTP预混在一起。

本发明第三方面提供本发明第一方面所述的引物组合在制备基于高通量测序检测低微生物量生物样本中细菌的试剂盒中的应用。

本发明第四方面提供一种检测低微生物量生物样本中细菌的方法，包括以下步骤：

S1，获得所述低微生物量生物样本的DNA样本；

S2，利用权利要求1所述的引物组合对所述DNA样本进行PCR扩增；