[发明专利]玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用

说明书

本发明专利属于玉米基因克隆领域，是对玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用的研究。具体涉及玉米叶片总RNA提取、反转录成cDNA及实时荧光定量PCR(RT‑PCR)、基因克隆，表达方法包括原核表达载体pET28a‑ZmSphK1、植物表达载体pCambia1300‑ZmZmSphK1的构建、菌液PCR及酶切鉴定、质粒转化农杆菌感受态、质粒转化菌使用蘸花法转化拟南芥植株等步骤，利用转化拟南芥植株研究玉米基因ZmZmSphK1在盐胁迫中的功能，为玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因功能的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于玉米基因克隆技术领域，具体涉及一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆在盐胁迫中的应用

背景技术

作为人们主要的粮食作物及饲料来源之一的玉米，因其广泛的应用价值及低廉的成本，一直受到世界各国学者的重视和青睐。在我国，玉米已成为三大作物中总产量最高、种植面积最大、单产仅次于水稻的重要作物。然而，玉米对盐胁迫的耐受性是很弱的。当处于盐胁迫下，植株的生长会受到抑制，净光合速率、叶绿素含量和根系活力明显降低，且对地上部的影响大于对地下部的影响。过高的盐浓度可能导致玉米生长迟缓、作物减产甚至大面积枯萎。所以，玉米耐盐性的研究，对于提高玉米产量、培育优良耐性品种有重要意义。

膜脂的重要组成部分——鞘磷脂，其代谢产物鞘磷脂-1-磷酸(S1P)在动物细胞中是一种非常有效的脂质介导物，在动物系统的多个生物学过程中起到重要的作用。而鞘氨醇激酶(SphK)是S1P合成所需要的关键的酶，鞘氨醇在鞘氨醇激酶的催化下形成S1P。鞘氨醇激酶是一类新的脂类激酶，该酶具有高度的进化保守性,在人、小鼠、酵母和植物中有表达，在线虫和果蝇中有类似激酶存在。在哺乳动物中已经鉴定有SphK和SphK2这两种鞘氨醇激酶存在。根据近年研究发现，在植物体中也有S1P的存在，除了对植物的生长发育过程有作用以外，在逆境胁迫中也起到了必不可少的作用。最近已经被证明的是，合成S1P的酶——鞘氨醇激酶(SphK)，是由拟南芥(Arabidopsis thaliana)保护细胞中的植物激素脱落酸刺激产生的；S1P能有效地调控保护细胞的开闭。近年研究指出，S1P可能参与了植物体内的多种信号转导途径：①植物在对非生物胁迫时，其抗逆性与适应性主要取决于植物激素脱落酸(ABA)的控制，而S1P能参与ABA介导的干旱信号转导途径；②钙离子作为许多逆境胁迫的第二信使，对于植物体来说能产生提高抗逆性的非常好的作用。而S1P能参与调节植物体内钙离子浓度，并且可能在保卫细胞的信号转导过程中起作用，它可以通过引起钙离子浓度变化而影响气孔的开闭，S1P引起的气孔关闭程度与其在细胞体内的剂量呈现出特异性，高浓度引起的效应更快。然而,在植物抵抗盐胁迫时，S1P如何起作用，到目前为止仍然不清楚。研究植物抗逆系统中的各种酶，从而为植物抵抗逆境胁迫提供一个良好的育种策略，是目前研究的热点。为此，我们克隆鉴定了玉米中S1P合成和代谢有关的鞘氨醇激酶基因ZmSphK1。

发明内容

本发明提供了一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因克隆、克隆方法，可以有效克隆和表达玉米ZmSphK1基因。

第一个目的是提供一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆方法，具体步骤为：

(1)材料的准备与处理：玉米自交系品种“1104”、品种“Mo17”由分子育种实验室提供。将营养土以及蛭石按照适量的比例混合后，挑选籽粒饱满的种子各10粒进行种植，将剪取的叶片放在超低温冰箱中保存以供RNA提取使用；

(2)玉米叶片的总RNA的提取：本实验采用Takara RNA提取试剂盒提取叶片的RNA，此外还需要DNaseⅠ反应去除所提RNA中的DNA污染。整个的提取过程都应该在冰上进行操作，并且佩戴口罩；