[发明专利]提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法

权利要求书

1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是将谷氨酸棒杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源的乙醛脱氢酶基因启动子Pald，并将外源的NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因经密码子优化后，通过质粒导入谷氨酸棒杆菌中或通过基因工程手段整合到谷氨酸棒杆菌染色体上构建得到的。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因来源于变形链球菌(Streptococcus mutans)。

3.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因由Psod启动子驱动。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 21543。

5.重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段将谷氨酸棒杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源的乙醛脱氢酶基因启动子Pald，并在谷氨酸棒杆菌中过表达由Psod启动子驱动的来源于变形链球菌的NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、重组菌C.glutamicum-ald的构建

a1、以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-up-F和ald-up-R为引物进行PCR，获得基因片段ald-up并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-F和ald-R为引物进行PCR，获得基因片段ald并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-down-F和ald-down-R为引物进行PCR，获得基因片段ald-down并进行PCR产物纯化；

a2、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用GibsonAssembly试剂盒将基因片段ald-up、ald、ald-down一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-ald；

a3、将pK18-ald转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中，获得的重组菌命名为C.glutamicum-ald；

所述重组菌C.glutamicum-ald包含序列如SEQ ID NO:1所示的由Pald启动子驱动的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA；

B、重组菌C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN的构建

b1、人工合成含有Psod启动子以及密码子优化的来源于变形链球菌的NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN，序列如SEQ ID NO:3所示，将该片段连接到谷氨酸棒杆菌的穿梭载体pXMJ19上，获得的重组质粒命名为pXMJ-gapN；

b2、将重组质粒pXMJ-gapN转化到重组菌C.glutamicum-ald中，获得的重组菌命名为C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN；

其中，引物序列如下：

ald-up-F：5′-cacagaattcgcaattttaaggtttgctggtg-3′；

ald-up-R：5′-agtggcgtcgacaagcatgttttttgcagggaacgaacctg-3′；

ald-F：5′-caggttcgttccctgcaaaaaacatgcttgtcgacgccact-3′；

ald-R：5′-ataccaacacgaatggtcattgggtctcctttgggccacc-3′；

ald-down-F：5′-ggtggcccaaaggagacccaatgaccattcgtgttggtat-3′；

ald-down-R：5′-cacatctagattagagcttggaagctacgag-3′。