[发明专利]甘氨酸增强的一步法CRISPR反应及其在新型冠状病毒检测中的应用

说明书

本发明公开了甘氨酸增强的一步法CRISPR反应及其在新型冠状病毒检测中的应用。本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘氨酸增强的一步法CRISPR反应及其在新型冠状病毒检测中的应用。本发明将甘氨酸应用在制备增强CRISPR/Cas13试剂检测核酸的灵敏度的产品中，其中CRISPR/Cas13试剂包含特异于待检测核酸的crRNA、Cas13蛋白和荧光报告探针。在针对新型冠状病毒N基因的检测中，相较于无甘氨酸的一步法CRISPR反应，甘氨酸增强一步法CRISPR反应的灵敏度提高了10倍，达到1拷贝/微升(5拷贝/反应)。本发明有望为CRISPR反应真正走向临床和现场检测应用提供有力技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘氨酸增强的一步法CRISPR反应及其在新型冠状病毒检测中的应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种传染性强、发病率高且易在人与人之间传播的呼吸道病毒。因此，快速准确的检测新型冠状病毒是限制疫情进一步扩散的最有效途径。

新型冠状病毒的主要检测方法包括核酸扩增检测、测序、免疫学检测。实时反转录聚合酶链式反应(real time reverse transcription PCR，rRT-PCR)被认作是临床检验的金标准，但是RT-PCR与基因测序都受制于昂贵精密的仪器设备、熟练掌握技能的操作人员以及较长的检测时间。免疫学检测技术也常用作病原微生物检测，例如酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，胶体金免疫层析、量子点免疫层析等方法。但免疫学检测易受病程影响，患病早期，可能因病人体内抗体含量较少，出现假阴性；康复期病人易带有该类抗体，出现假阳性。因此，亟待开发一种快速、准确、高灵敏的病毒核酸检测方法。

规律间断成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)技术因其卓越的检测机制、快速的反应效率、优异的检测灵敏度、简易的外部反应条件而被广泛的应用于现场快速检测(point-of-care testing，POCT)，通过特有的旁系切割特性，即Cas13蛋白结合体外合成的crRNA，在特异性识别RNA序列的同时，非特异的切割标有荧光淬灭的单链RNA报告基团，从而实现对于靶标的精准高效检测。然而，现有两步法CRISPR反应需扩增产物转移操作，存在气溶胶污染风险。而现有一步法CRISPR反应耗时长，灵敏度低，无法满足实际应用需求。基于上述背景，亟待开发一种快速高灵敏的一步法CRISPR反应，为CRISPR 反应真正走向临床和现场检测应用提供有力技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有一步法CRISPR反应存在反应时间长、反应效率低、灵敏度有限等实际问题，无法满足实际检测应用需求。

本发明提供了甘氨酸在制备增强CRISPR/Cas13试剂检测核酸的灵敏度的产品中的应用，所述CRISPR/Cas13试剂包含特异于待检测核酸的crRNA、Cas13蛋白和荧光报告探针，所述荧光报告探针是一端连有荧光基团，另一端连有淬灭基团的单链RNA。

上述应用中，所述检测核酸通过一步法进行，所述一步法不包括将核酸扩增产物转移的步骤。

上述应用中，所述CRISPR/Cas13试剂的检测样本来源于含有RNA的生物，所述CRISPR/Cas13试剂含有逆转录酶。

所述荧光报告探针的单链RNA的核苷酸序列为表3中所示。

上述应用中，所述CRISPR/Cas13试剂含有甘氨酸，所述CRISPR/Cas13试剂中，crRNA和甘氨酸的配比为50nM crRNA:0.1g/mL甘氨酸。