[发明专利]一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用

说明书

本发明提供了一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用，本发明从SARS‑CoV‑2 Delta中提取了S蛋白基因的813nt片段作为shRNA靶点；813nt含有S蛋白基因RBD的大部分和的RBD之后部分下游区，基于这个813nt片段序列，设计、制备了shRNA688并进行了RNAi实验。本发明提供的shRNA其序列中有义序列为GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C，如SEQ ID NO.10所示，本发明的shRNA显著降低了S蛋白mRNA Est813转录物的浓度。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种RNAi疗法，具体涉及一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用。

背景技术

全球新冠病毒-19大流行是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的。疫苗能显著减缓阳性病例和死亡人数的增加，然而，疫苗接种可能无法完全覆盖全球人口。此外，SARS-CoV-2变异株对先前的感染或疫苗接种而逃避免疫，这种变异株不断出现。Omicron变异体的出现表明SARS-CoV-2进化的速度有多快，其对当前主要针对高度突变的棘突(S)蛋白的，基于蛋白质干预(即疫苗、抗体或恢复期血浆)的潜在影响不容忽视。抗新冠病毒药物治疗中的一个新兴概念涉及基于核酸的疗法的开发，该疗法可以降解病毒基因组，并可以根据病毒突变而快速调整。基于核酸的疗法包括小干扰RNA(siRNAs)。这些约19～21个碱基对长的非编码RNA双链，能够通过介导靶向mRNA降解，以序列特异的方式击倒靶基因的表达。经细胞摄取后，siRNA双链被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中。双链被加工成单链，与细胞质中存在的互补RNA具有高度特异性结合，导致其分离。正在进行的疫情大流行促使多个研究小组评估基于siRNA的新冠病毒治疗。虽然迄今为止发表的大多数研究都回顾了RNA干扰治疗新冠病毒的潜力，通过计算机预测研究进行了描述，也提供了初步的概念推理认证，即SARS-CoV-2可以被siRNA抑制。针对SARS-CoV-2RNA基因组的Orf1a/b区域设计的siRNA，编码非结构蛋白(nsp)，进行了测试。发现了一种高效抑制SARS-CoV-2复制的siRNA。对共同表达针对SARS-CoV-2RdRp和N基因的短发夹RNA(shRNAs)混合物的腺相关病毒载体进行了检测。结果表明，RNAi具有治疗干预的潜力和前景。深入了解有效抑制病毒复制是制定有效抗病毒策略的必要条件。

SARS-CoV-2是一种有外壳的单链大RNA病毒，具有5'端非翻译区(UTR)，ORF1a/bRNA编码非结构病毒蛋白，3'端段编码结构蛋白，例如与人宿主细胞上的人类血管紧张素转换酶2(hACE2)受体结合的S蛋白，以及参与病毒粒子组装的核衣壳N蛋白，和3'UTR。作为对新冠病毒大流行的全球应对措施，公共数据库中提供了大量SARS-CoV-2变体的基因组，包括SARS-CoV-2变体S蛋白基因和蛋白质序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？Term＝SARS-CoV-2％2C+S+protein).S蛋白的动态特性，尤其是更易传播的Delta和Omicron变体已经发布了。Omicron S蛋白，包括RBD中积累了更多的突变。S蛋白受体结合域(RBD)的突变影响其与ACE2的亲和力。SARS-CoV-2具有较大的RNA基因组，但在人肺上皮细胞的细胞质中复制时，没有整合到人类基因组中。病毒的复制是一个连续的过程，而亚基因组mRNA的转录是一个不连续的过程。研究了腺苷类似物(SARS-CoV-2RNA依赖RNA聚合酶抑制的主要重组药物)的抗病毒效果。使用核酸反义寡核苷酸被描述为一种潜在的针对SARS-CoV-2RNA的新型治疗策略。与SARS-CoV-2的5′先导序列结合的反义寡核苷酸破坏了高度保守的干环结构，具有纳米级效力，可防止病毒在人类细胞中复制。

对于阻止SARS-CoV-2大流行新疫苗和药物的发明迫在眉睫。虽然目前已经研发制备了一些具有预防效果的疫苗和治疗性的中和抗体来针对已发现的SARS-CoV-2。但是，由于病毒正在不断变异，之前的成果已经不能满足对付病毒新的突变株。许多国家的科学家也都在争分夺秒地研制抗病毒的治疗药物。