[发明专利]一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提升的肌酸脒基水解酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明通过对产碱杆菌来源的肌酸脒基水解酶进行无系统发育偏见的共识设计，获得热稳定性显著提高的突变酶。与野生型半衰期相比，最优组合突变体最高半衰期提升2841倍，这表明突变体相比于野生型，其稳定性得到了显著的提升。

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2020年8月28日；申请号：202010886832.3；发明名称“一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体”。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体。

背景技术

肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶，它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素，进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物，目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。

肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液，排出体外。一般来说，血清肌酐的正常范围在35～150μm之间，但当肾功能或肌肉功能出现问题时，肌酐含量会上升至1000μm，血液和尿液中的肌酐含量可以反映肾脏的排泄功能。目前为止检测肌酐含量最常用的是Jaffe化学检测方法和酶比色法。相比之下，由于酶促检测法较高的灵敏度和选择性等特点，日益受到关注。在酶促检测方法中，待测样品通过肌肝水解酶，肌酸脒基水解酶和肌氨酸氧化酶连续转化，最终肌酐被降解为过氧化氢，通过在辣根过氧化物酶催化下的比色反应来确定过氧化氢的浓度，从而达到检测肌酐含量的目的。

因此，为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本发明利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的肌酸脒基水解酶突变体、本发明采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到21个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶热稳定性差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。

发明内容

为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本发明利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的肌酸脒基水解酶突变体、本发明采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到21个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶热稳定性差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。

本发明第一个目的是提供一种肌酸脒基水解酶的突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体氨基酸序列为如下(a1)或(a2)所示：

(a1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.1的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；

(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.1示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。

优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第6位、第17位、第58位、第108位、第117位、第165位、第199位、第251位、第349位及第351位。

进一步优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQID NO.1示的氨基酸序列上L6P、D17V、G58D、F108Y、T117P、Q165I、T199S、T251C、E349V、K351E中任一单点突变位点的单点突变体。