[发明专利]一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法

权利要求书

1.CYP539A7*-F₀CPR*融合基因在生产10-羟基-2-癸烯酸中的应用，所述CYP539A7*-F₀CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，CYP539A7*-F₀CPR*融合基因在酵母菌发酵生产10-羟基-2-癸烯酸中的应用。

3.一种生产10-羟基-2-癸烯酸的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建含有重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-crp5p或pJEF3-CYP539A7*-F₀CPR*的酵母工程菌；所述CYP539A7*-F₀CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述构建方法中，酵母工程菌使用的宿主酵母菌为酿酒酵母菌株BY4741。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述构建含有重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-crp5p或pJEF3-CYP539A7*-F₀CPR*的酵母工程菌，步骤如下：

(i)将基因CYP539A7密码子优化，得到优化后质粒pET28a-CYP539A7*，以质粒pET28a-CYP539A7*为模板PCR扩增基因CYP539A7*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将基因F₀CPR密码子优化，得到优化后质粒pET28a-F₀CPR*，以质粒pET28a-F₀CPR*为模板PCR扩增基因F₀CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

以酿酒酵母基因组为模板PCR扩增辅助基因sil1p，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

以酿酒酵母基因组为模板PCR扩增辅助基因crp5p，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

以重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*为模板PCR扩增融合基因CYP539A7*-F₀CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

然后将质粒pESC-URA用BamH I和Xho I进行双酶切；重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*用EcoR I和Cla I进行双酶切；质粒pJEF3-URA用BamH I和Pst I进行双酶切；

所述步骤(i)中CYP539A7*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，F₀CPR*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，辅助基因sil1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，辅助基因crp5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CYP539A7*-F₀CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQID NO.15所示；

(ii)将步骤(i)扩增的CYP539A7*、F₀CPR*基因片段和酶切后的载体pESC-URA进行无缝克隆，得到重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*；

将步骤(i)扩增的sil1p、crp5p基因片段和酶切后的载体pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*分别进行无缝克隆，得到重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-crp5p；

将步骤(i)扩增的CYP539A7*-F₀CPR*融合基因片段和酶切后的载体pJEF3-URA进行无缝克隆，得到重组质粒pJEF3-CYP539A7*-F₀CPR*；

(iii)将步骤(ii)的重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F₀CPR*分别转入宿主酵母菌，筛选阳性酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-sil1p、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F₀CPR*-crp5p、酵母工程菌/pJEF3-CYP539A7*-F₀CPR*。